[发明专利]一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒

权利要求书

1.一种检测待测生物样本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的双色荧光多重PCR方法，包括如下步骤：将待测生物样本的总DNA作为模板，用引物对甲和引物对乙进行多重PCR；将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本中含有DNA片段甲；引物对甲的5’端用Tamra标记，引物对乙的5’端用Cy5标记；所述引物对甲用于扩增DNA片段甲；所述引物对乙用于扩增DNA片段乙。

2.一种检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒的方法，包括如下步骤：将待测生物样本的cDNA为模板，用引物对A和引物对B进行多重PCR，将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H3亚型禽流感病毒；如果532nm下具有荧光条带，待测生物样本含有H6亚型禽流感病毒；所述引物对A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的反应条件为：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的反应体系中，反应初始时，每个引物对的上游引物和下游引物的浓度均为0.1mmol/L。

5.一种检测待测生物样本中是否含有H3亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒的试剂盒，包括引物对A和引物对B；所述引物对A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记。

6.一种检测待测生物样本中含有如下哪一种亚型禽流感病毒的方法：H1亚型禽流感病毒、H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、N1亚型禽流感病毒、N2亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒，包括如下步骤：

将待测生物样本的cDNA作为模板，用引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI和引物对VII进行多重PCR，将多重PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用荧光成像分析仪分别在532nm和635nm下进行凝胶扫描分析；如果635nm下具有641bp的荧光条带，待测生物样本含有H1亚型禽流感病毒；如果635nm下具有708bp的荧光条带，待测生物样本含有H3亚型禽流感病毒；如果635nm下具有419bp的荧光条带，待测生物样本含有H5亚型禽流感病毒；如果532nm下具有367bp的荧光条带，待测生物样本含有N1亚型禽流感病毒；如果532nm下具有338bp的荧光条带，待测生物样本含有N2亚型禽流感病毒；如果532nm下具有724bp的荧光条带，待测生物样本含有H6亚型禽流感病毒；如果532nm下具有532bp的荧光条带，待测生物样本含有H9亚型禽流感病毒；所述引物对I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对，序列2所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对，序列6所示核苷酸的5’端用Cy5标记；所述引物对IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成的引物对，序列8所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸组成的引物对，序列10所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸组成的引物对，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra标记；所述引物对VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对，序列14所示核苷酸的5’端用Tamra标记。