[发明专利]一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其衍生条件，属于分析化学领域。 

技术背景

含有氨基的化合物就是氨基化合物，氨基化合物和人类日常生活及社会生产发展密切相关，包括食品和饲料中的氨基酸及生物胺、动植物体蛋白质(多肽)、医药氨基用品、氨基化工中间体、含氨基农用化学用品等，是一类对人类及环境至关重要的化合物，也是一类非常需要进行检测跟踪的物质。随着科学技术的发展，这类化合物的检测方法也得到了长足的进步，其中以高效液相色谱(HPLC)为基础的检测方法，是近些年来发展迅速的分析手段之一。HPLC检测法具有检测灵敏度、精确度高，检测所需时间少，检测结果重复性高，高效相色谱柱可反复使用，检测可实现操作自动化等优点，是当前分析化学和生物化学中是必不可少的。但是氨基化合物分为两类，一类是自身化合物分子中带有发色基团，本身具有紫外或荧光吸收，可以直接通过HPLC方法检测；另一类是本身不具有发色基团的，不能直接在高效液相色谱上进样检测，比如氨基酸、生物胺等，这类氨基化合物需要和一些具有强烈紫外/荧光吸收的氨基衍生化试剂进行反应后，才能够被HPLC检测器检测。 

目前所用的氨基衍生化试剂有很多种，包括荧光胺(FA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰一亚胺基-甲酸酯(AQC)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、邻苯二甲醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)等。经文献检索，文章《湖南化工》1999年4月第2期9-11；《色谱》2004年5月第3期210-215；《分析化学评述与进展》2005年3月第3期398-404等综述了以上氨基衍生化试剂的优缺点。其主要缺点表现在：有的氨基衍生化试剂只能与一级氨反应，而不能与二级氨反应，比如OPA；有的氨基衍生化试剂反应条件苛刻，需要无水环境，比如Dansyl-Cl；有的氨基衍生化试剂反应会形成的副产物，对色谱分离造成干扰，比如 PITC；有的氨基衍生化试剂检测灵敏度低，比如DNFB等。 

发明内容

本发明针对高效液相色谱分析氨基化合物所用氨基衍生化试剂的不足和缺陷，提供了一种氨基化合物高效液相色谱分析用柱前衍生化试剂及其衍生条件，提高氨基化合物在高效液相色谱中的可检测性与灵敏度，以达到快速、准确、灵敏的检测氨基化合物的目的。 

本发明是通过以下技术方案实现的，以3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯(CNBF)为衍生化试剂与氨基化合物进行衍生化反应，控制反应的体系组成、pH、反应物摩尔比、温度、时间等条件，然后通过高效液相色谱进行分离检测，其步骤如下： 

1、确立氨基化合物标样与CNBF进行衍生化反应条件；2、衍生产物HPLC分离检测方法建立；3、氨基化合物样品的前处理；4、样品的衍生化反应；5、样品的检测。 

其衍生化反应方程式如下： 

其中R1、R2为不同的取代基，包括：氢、烃基、羧基、羟基、硝基、三唑环等杂环取代基。 

所述步骤1中的氨基化合物标样与CNBF衍生化反应条件包括：反应物摩尔比、温度、时间、pH。在衍生化反应体系中氨基化合物与CNBF的摩尔比例为1∶1-8.0，最佳比例为1∶3-5；控制反应温度在40-80℃，最佳温度为50-60℃；反应体系pH值7.5-10.0，最佳pH为9.0-9.5；控制反应时间30-80min，最佳反应时间为30-40min。 

所述步骤2中的高效液相色谱分离检测方法包括：高效液相色谱柱的选择、流动相的选择、流动相的梯度设定、流动相的流速、检测波长及时间、建立检测标准曲线。其中高效液相色谱柱为普通反向C18色谱柱；流动相有机相为甲醇、乙腈的一种或两种混合，流动相水相为纯水、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、离子对溶液的一种，其pH一般在3-10；流动相梯度根据氨基化合物不同，分别设定；流动相流速为0.4-1ml/min。检测波长一般在230-360nm，检测时间5-60min。 

所述步骤3中的氨基化合物样品的前处理包括：动植物蛋白质的酸解而释放游离氨基化合物；氨基化合物的萃取等。其中蛋白质酸解包括用6mol/L浓盐酸在120-150℃水解，也可以用浓硫酸、三氟乙酸等强酸水解；氨基化合物的萃取包括：硼酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液等缓冲溶液萃取，乙醇、乙腈等有机溶剂萃取、固相萃取、浊点萃取等。