[发明专利]基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR检测方法及其应用，特别是涉及一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法及其在制备实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。

背景技术

1996年，实时荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司首先推出。所谓实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通过与加入已知量的标准品进行比较，可实现实时定量检测。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

目前，根据实时荧光定量PCR所使用的荧光化学物质的不同，荧光定量PCR技术主要分两类，荧光染料和荧光探针。其中荧光探针包括Taqman探针、分子信标、FRET探针、蝎式探针等。荧光染料主要包括YO-PRO-1、SYBR Green I、BEBO和LC Green等。荧光染料定量PCR的优势在于它使用方便，不需要设计复杂的荧光，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。而且，它能监测任何双链DNA序列的扩增，没有引物特异性，可以用于不同的模板。然而，正是由于荧光染料能和任何双链DNA结合，因此它也能与非特异的双链DNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用熔解曲线(melting curve)加以解决，来区分特异性和非特异性扩增。因此，作为一种方便快捷的定量PCR方法，荧光染料定量PCR应用非常广泛。

SYBR Green I因为其毒性低、价格便宜，成为最常使用的一种定量PCR荧光染料。但是，SYBR Green I也存在一些明显的不足。例如，在未进行优化之前不能用于普通PCR缓冲液中，并且需要额外的试剂(如DMSO、BSA等)来增加反应的效率。尽管通过提高MgCl₂的浓度可以在一定程度上减小其抑制效应，但SYBR Green I仍可以浓度依赖的方式抑制PCR反应。这种抑制效应可能是由于染料的分解产物所致。目前，SYBRGreen I已被广泛应用于病原的检测。但是，利用该染料所做的熔解曲线(Tm)可受到染料和DNA浓度的影响。例如，3倍浓度的起始DNA的差异，就可能引起1度的Tm值的变化。SYBR Green I的另一个缺点是在多重PCR中应用有限。研究发现，进行双重PCR扩增时，熔解曲线只能检测到一个产物，而电泳分析可以明显观察到两个产物。这个可能与扩增DNA和染料的相对浓度有关。尽管SYBR Green I的应用范围较广，但是存在染料可用浓度范围小、序列结合偏性大等缺点。

SYTO家族的染料是一种比较常见的DNA结合染料，它具有很多特性，包括膜通透性、低细胞毒性、结合DNA后荧光增强等，这些特性使得它们适合于标记活细胞。但是它们对双链与单链DNA的特异性结合能力不清，或者说它们作为定量PCR的染料是否合适仍不清楚。

发明内容

本发明提供了一种对PCR反应的抑制效应小、可用浓度范围大、序列结合偏性小、敏感性高的新型DNA结合染料，并建立了基于该染料的实时荧光定量PCR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种基于新型DNA结合染料的实时荧光定量PCR检测方法，是以SYTO为荧光染料进行的实时荧光定量PCR检测方法。

所述SYTO荧光染料优选为SYTO82。

所述SYTO荧光染料的浓度优选为2μM。

所述PCR反应体系优选为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，MgCl₂(25mM)2μl，上游引物(10μM)：0.5μl，下游引物(10μM)：0.5μl，rTaq酶(5U/μl)：0.125μl，模板DNA：1μl(含1.0×10¹～10⁹拷贝)，染料1μl，加水补齐至终体积25μl。

所述实时荧光定量PCRPCR反应条件优选为：预变性：94℃ 3min；扩增95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环；72℃ 10min。

所述实时荧光定量PCR检测方法可包括以下步骤：

1)将SYTO为荧光染料加入上述PCR反应体系中；

2)按上述反应条件进行PCR反应。

本发明的第二个目的是提供一种实时荧光定量PCR检测试剂盒。