[发明专利]禽流感病毒H5N1假病毒及其制备方法与专用DNA片段

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及假病毒及其制备方法与专用DNA片段。

背景技术

禽流感病毒H5N1株导致最近亚洲家禽的流行性死亡，同时该病毒可以感染人，并有很高的致死率。为了研制能够抑制该病毒进入细胞的药物，我们将利用禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白基因，建立假病毒筛选平台，这个平台可以用于筛选抑制禽流感病毒进入细胞的小分子药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一个DNA片段。

本发明提供的DNA片段的核苷酸序列如序列表序列2所示。

含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是将上述的DNA片段插入pcDNA3.1的多克隆位点之间，得到的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种假病毒的制备方法。

本发明提供的假病毒的制备方法是如下方法1)或方法2)：

1)上述的DNA片段和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒；

2)上述的DNA片段、禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒。

上述逆转录慢病毒载体中可插入有报告基因；所述报告基因是分泌型胎盘磷酸酯酶基因、β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或绿色荧光蛋白基因；所述报告基因优选是萤火虫荧光素酶基因；所述逆转录病毒载体是pNL4-3.1uc.E-R-。

上述方法1)中，上述的DNA片段是通过上述的重组载体导入受体细胞的。

上述方法2)中，上述的DNA片段是通过上述的重组载体导入受体细胞的；禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因是通过将禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因插入pcDNA3.1的多克隆位点之间构成的重组载体导入受体细胞的。

上述受体细胞是真核生物的传代细胞；所述真核生物的细胞可以为HEK-293T细胞。

按照上述方法制备的假病毒也属于本发明的保护范围之内。

本发明的又一目的在于提供一种假病毒细胞模型，是将上述的假病毒感染哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述哺乳动物细胞可为MDCK细胞。

本发明又一目的在于提供上述假病毒或假病毒细胞模型在禽流感药物筛选中的应用或者在禽流感病毒中和抗体研究中的应用。

上述禽流感药物为病毒膜蛋白抑制剂。

本发明又一目的在于提供上述假病毒或假病毒细胞模型在进行禽流感病毒中和抗体研究中的应用。

本发明对禽流感病毒H5N1株全长HA基因按照真核细胞高丰度密码子进行优化和全人工合成，并和NA基因的表达质粒以及带有报告基因表达质粒的HIV骨架质粒共感染293T细胞，包装出假病毒，包装出的假病毒可以感染MDCK细胞。假病毒感染模型的建立为寻找新的H5N1禽流感病毒的受体，研究该病毒的侵染机理，寻找抗病毒的药物，研究抗病毒的中和抗体和疫苗效果评价提供了新的简便的实验方法。

附图说明

图1为HA单独包装得到的假病毒的感染能力图，其中A是含优化后的HA基因的假病毒的感染能力结果；B是含未优化的HA基因的假病毒的感染能力结果

图2为HA和NA共包装得到的假病毒的感染能力图，其中A是含优化后的HA基因的假病毒的感染能力结果；B是优化后的HA和NA共包装得到的假病毒的感染能力结果。

图3为利用流感病毒药物(达菲)对假病毒体系进行检测，其中A是在包装病毒时加入20uM达菲后，同时病毒感染时加入不同量的达菲后的感染效果图；B是在包装病毒时不加入达菲，同时病毒感染时加入不同量的达菲后的感染效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.假病毒的制备及其检测

一、假病毒的制备

1、含H5N1禽流感病毒的优化后的全长血凝素蛋白(HA)基因的重组载体的制备

1)获得优化后的HA编码基因

针对禽流感病毒H5N1株HA的氨基酸序列(如序列表序列1所示)，按照真核细胞高丰度密码子优化原则，推导出编码序列1所示氨基酸的核苷酸(其序列如序列2所示)，然后人工合成优化过的核苷酸。

人工合成一对引物，在引物上分别加上BamH I和EcoR I酶切位点，引物序列如下：

上游引物：5’-CGGATCCGCCACCAGCATGGAGAAGATCGTGCTG-3’；