[发明专利]一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。

背景技术

水稻矮缩病毒(rice dwarf virus，RDV)是水稻普通矮缩病的病原，1883年首次在日本被发现，广泛分布于中国、日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻产区。此病在水稻秧田和本田期均能发生，为系统性侵染病害。植株感病后，所有分蘖均能发病。症状为植株显著矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片粗而僵直，沿叶脉出现白色小斑点，形成断续的点线状(老叶不出现斑点)；如在孕穗后期发病，只在剑叶及其叶鞘上表现清晰的条点病斑；若在抽穗后发病，仅在剑叶叶鞘上表现病斑。病株根系发育不良，多老朽根，早期发病(苗期到分蘖期)一般不能抽穗，后期发病呈包茎穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染该病后能够造成大面积减产，严重威胁水稻的生产。

RDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员(Boccardo G，1984)。呼肠孤病毒科病毒有一些共同特点，例如病毒粒子呈球状，有双层衣壳，每个衣壳均呈现20面体对称，直径为60-80nm，没有脂蛋白外膜，外壳由3种蛋白质组成，核心有4-6种蛋白，核心内含有线状dsRNA，有10-12个基因组分。RDV病毒粒子为无刺突、无脂蛋白外膜的二十面体，病毒粒子直径为69.3nm，具有双层外壳蛋白，内壳直径为53nm。RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，RNA基因组分以超卷曲形式包装在病毒粒子内，与蛋白质组成复合体。依照dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，由慢到快，依次命名为S1到S12。RDV基因组编码6-7种结构蛋白(包括P1，P2，P3，P5，P7，P8和P9)，和至少五种非结构蛋白(包括Pns4，Pns6，Pns10，Pns11，Pns12)。

Pns11的编码序列有两个ORF，这两个ORF的读码框相同，但第二个ORF的AUG密码子满足Kozak保守转录的要求，在感病的植株和昆虫体内表达量较高。其编码一个181个氨基酸组成的20KD蛋白。S11的3’非编码区很长，占整个片段的46.4％，远远高于RDV其他片段3′非编码区的相对长度(约占3.1％-17.7％)。

发明内容

本发明的目的是提供一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。

本发明提供了一种具有细胞核和/或叶绿体定位功能的多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。

编码所述多肽的DNA片段也属于本发明的保护范围。

所述DNA片段的核苷酸序列可如序列表的序列2所示。

含有所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为将编码所述多肽的DNA片段插入载体pRTL2的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是用所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达。

所述方法可通过将含有所述DNA片段和所述外源蛋白的编码基因的融合DNA导入植物细胞实现；所述融合DNA中，编码所述多肽的DNA片段位于所述外源蛋白的编码基因的上游。具体来说，所述融合DNA通过如下重组表达载体导入所述植物细胞：骨架质粒为pRTL2，在35S启动子后依次插入编码所述多肽的DNA片段和外源蛋白的编码基因。

所述植物细胞为可烟草细胞，如烟草BY2细胞。

所述外源蛋白可为GFP蛋白。所述GFP基因具体可为GENBANK ACCESSIONNUMBER：U55761中自5’末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。所述融合DNA具体可为序列表的序列6所示的DNA。

本发明通过实验证实了水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns11的C端132-180多肽(第二个ORF)具有将外源蛋白特异定位到细胞核和叶绿体中的功能。不仅为在细胞核中特异表达抗逆，抗病害相关基因，提高植物生存能力提供了良好技术路线，同时也为在叶绿体中表达激活光合作用反应的相关基因，提高农作物生物产量提供了新的技术支持。本发明在实际生产中有重要的应用价值。

附图说明

图1为pRTL2-S11::eGFP在烟草表皮细胞中的瞬时表达；A：pRTL2-S11::eGFP荧光；B：pRTL2-S11::eGFP可见光；C：pRTL2-S11::eGFP荧光和可见光叠加；D：pRTL2-eGFP荧光；E，F：pRTL2-S11::eGFP在烟草表皮细胞核中定位的放大图。