[发明专利]一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物保护和质检领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

2006年夏秋季节，江西、湖南、湖北、安徽及江苏南京、无锡、扬州、苏州等国内主要养猪地区都会发生一种以高热、食欲下降、呼吸困难和繁殖障碍为主要特征的传染病，由于病原尚未明确，根据病猪体温升高的临床特点，将该病称为“猪无名高热”或猪“高热病”等。高热病广泛蔓延，流行数月。13～25周龄的生长育肥猪多发。发病率10％～80％不等，死亡率20％～50％不等。共同症状表现为体温40.5℃以上高烧不退，呼吸急促、咳嗽或流鼻涕，多数病猪皮肤潮红。不同猪群尚表现便秘、腹泻、肢体麻痹、母猪流产和口鼻腔流血等。所有病死猪都以表现严重的肺炎病变为典型特征，全身淋巴结水肿、出血，肝脏肿大或有坏死点，脾脏肿大，皮下出血，胸腔和腹腔积水，胃底和小肠粘膜出血，心脏冠状沟出血点，心包积液及膀胱粘膜出血点或斑等。以磺胺药为主或单纯地当蓝耳病、流感、猪瘟来防治，结果均较差，对症治疗效果亦不佳。此次疫病的流行和发生给我国养猪业造成了巨大经济损失，一些疫情严重的地区猪存栏量减少60％以上，不少中小型猪场因此而倒闭。此次疫情的流行造成病死及淘汰猪数量达数千万头，这对中国的养猪业而言不能不说确是一场灾难，这次灾难造成的损失要远大于1996年的猪繁殖与呼吸综合征病毒(蓝耳病)(PRRSV)和2002年猪圆环病毒2型感染所致的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，并引起了国务院、农业部和社会的高度关注，而且世界动物卫生组织(OIE)及国外兽医界都投予了注视的目光。2007年1月，猪“高热病”主要病原最终确定为变异PRRSV(NSP2 1594～1680变异株)，并定名为高致病性猪蓝耳病。PRRSV变异株NSP2基因的第483位和535-563位氨基酸发生缺失。 

目前临床诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典株的方法主要是采用RT-PCR，主要可分为两大类。一类是是分步检测，一次只能检测其中一种，譬如，中国动物疫病预防控制中心的专利“猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂盒”[200710086548]，这类方法重复操作、耗时较长、实验成本较高，容易带入人为误差，不适合基层应用等特点。另一类是鉴别RT-PCR的方法，譬如，郝晓芳等建立的以NSP2为唯一检测目的基因，以目标条带扩增大小为标准来鉴别PRRSV变异株和经典株[高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立，中国预防兽医学报；2007， 29(5)：704-709.]，何丹等建立的二重PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株[猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用，广西农业科学2009，40(1)：84-87.]，这类方法以NSP2为唯一检测目的基因，但是NSP2是PRRSV基因组中的高变区，存在较高的变异性，给实验结果带来潜在的不稳定性。 

非结构蛋白NSP9在不同PRRSV间同源性超过97.5％，具有较高的保守性，可以作为PRRSV诊断的目的基因。本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能准确、快速、灵敏、结果易于判读的用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对。 

本发明还要解决的技术问题是提供包含上述引物对的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒。 

本发明最后要解决的技术问题是提供采用上述试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法。 

为解决上述技术问题，本发明的思路如下：