[发明专利]一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对，其特征在于如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

2.一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，其特征在于包括：

(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株阳性对照细胞灭活毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性对照细胞灭活毒各600uL；

(2)猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株特异性引物对：

针对NSP2基因：上游引物P1：如SEQ ID NO：1所示；

下游引物P2：如SEQ ID NO：2所示；

针对NSP9基因：上游引物P3：如SEQ IDNO：3所示；

下游引物P4：如SEQ ID NO：4所示；

(3)RNA提取试剂：由Trizol 12mL，无菌DEPC水450μL；

(4)RT-PCR反应试剂：由RT反应液200μL，其中含反转录引物序列：RT引物如SEQ ID NO：4所示，RNA酶抑制剂24μL，AMV反转录酶12μL，5×buffer 60μL，dNTP25μL，2×PCR Master Mix 200μL组成；

(5)电泳检测试剂：由50×TAE电泳缓冲液20mL，GoldView 100μL组成。

4.采用权利要求1所述的试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)RNA的提取：

(1a)取待检组织0.5g，置于匀浆器或者研钵研碎后用1.5mL D-Hanks液稀释；取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，6000rpm离心5min；

(1b)取步骤(1a)离心得到的上清液300μL于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL Trizol混匀，室温下放置10min；再加入200μL氯仿混匀，室温下放置2min；

(1c)将步骤(1b)的灭菌离心管12000rpm离心10min，取600μL上层水相到另一1.5mL灭菌离心管中，加入600μL异丙醇混匀，室温下放置10min；

(1d)将步骤(1c)的灭菌离心管12000rpm离心10min，去上清，加入-20℃预冷的75％(v/v)乙醇溶液500μL，旋涡震荡混匀，7500rpm离心3min；

(1e)去除步骤(1d)离心后的上清，37℃干燥，用30μL DEPC水溶解即用或-70℃保存；

(2)反转录：

取16μL mRNA和如SEQ ID NO：4所示的RT引物25pmol/U、0.5μL混匀于PCR管中，放于PCR仪中65℃10min立即冰浴5min，再加入如下试剂：5×buffer 5μL、dNTP2μL、RNA酶抑制剂0.5μL、AMV反转录酶0.5μL，置PCR仪中50℃反转录1h，95℃3min灭活反转录酶后，-20℃保存备用；

(3)PCR：

25μL体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH₂O 6.5μL；上游引物P1 1μL；下游引物P2 1μL；上游引物P3 1μL；下游引物P4 1μL和模板2μL；

PCR反应条件：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，35个循环；72℃8min；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

准确称取0.3g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；

(5)判断结果：

如果扩增出约680bp和380bp特异性两条片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株阳性；

如果仅扩增出了约380bp特异性片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性；

如果没有扩增出片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典均阴性。