[发明专利]一种制备注射用小粒径重组人血管内皮抑制素缓释微粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种注射用小粒径重组人血管内皮抑制素缓释微粒的制备方法，尤其涉及一种采用特殊的二次乳化工艺，以可生物降解的乳酸-羟基乙酸聚合物为基质，包括重组人血管内皮抑制素和/或致孔剂的注射用缓释微粒的制备方法。

背景技术

美国哈佛医学院的Folkman教授在20世纪60年代提出“肿瘤生长依赖血管生长”学说，即实体瘤在生长和转移过程中，血管的生成起到了至关重要的作用，此时肿瘤细胞会发出一些促进血管向肿瘤组织增生的细胞因子(aFGF，bFGF，VEGF等)。一些内源性血管生成抑制因子如Endostatin能够通过一种内皮细胞特异性模式阻碍血管在肿瘤组织中的生长(O’Relly，M.S.，et al.Cell.88：277-285，1997)，组织中血管生成表型的开放与关闭将取决于组织局部区域血管生成刺激因子和抑制因子之间的动态平衡(Folkman，J.Nat.MED.1：27-31，1995；Hanahan，D.，et al.Cell.86：353-364，1996)。Folkman教授在上世纪七十年代提出了用血管内皮抑素(Endostatin)来抑制肿瘤生长的“饿死肿瘤疗法”理论。实验证明，Endostatin给药后可以在多种移植瘤模型中显著抑制人源性和动物源性的恶性肿瘤的生长和转移(O’Relly，M.S.，et al.Cell.79：315-328，1994；Yamaguchi，N.，et al.theEMBO journal.18：4414-4423，1999；Schuch，G.，et al.Leukemia.19：1312-1317，2005；Yokoyama，Y.and Ramakrishnan.S.，Cancer.104：321-331，2005)；Endostain是胶原蛋白18的C末端一个20kDa的片段，其氨基酸序列为：

(M) HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKP

罗永章教授等人通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带有9个附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(取名为：中文名：恩度)(ZL 00107569.1)，其氨基酸序列为：

(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除(其序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。

重组的人血管内皮抑制素Endostar保持内源性Endostatin的所有生物活性，同时解决了Endostatin在生产过程中复性困难的难题，表达水平更高，疗效更强，并且没有因为附加N端序列而导致体内免疫原性，其注射液已经获得国家药品食品监督管理局的批准上市销售，临床上联合NP化疗方案用于非小细胞肺癌患者。

但是作为外源性蛋白，重组的人血管内皮抑制素在体内很容易被免疫系统识别，进而被降解，因此体内半衰期很短。已上市的恩度注射液在14天的给药周期里每天需要滴注给药两小时，患者临床顺应性很差；同时二期临床试验的结果发现，总剂量和滴注次数可影响峰浓度和谷浓度水平，个体间药时曲线差异性很大，这在一定程度上影响了药物的疗效稳定性。近期有研究发现动物体内小剂量持续给予Endostatin的药效要优于间歇性给药(Minoru Kuroiwa，et al.J.Pediatr.Surg.38：1499-1505，2003；Oliver Kisker，etal.Cancer Res.61：7669-7674，2001)，这主要是增加了药物在体内的滞留时间，减小血药浓度的剧烈波动。因此有必要研究一种让Endostatin在体内能够长期缓慢释放的制剂。