[发明专利]一种蚓激酶制备工艺方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学制药技术领域，涉及一种蚓激酶制备工艺方法。

背景技术

血栓性疾病的高发病率、高死亡率及高致残率严重威胁人类的生存，溶栓性药物是治疗 该病的首选用药。目前临床上使用的溶栓性药物中普遍存在易引起出血的副作用；有的价格 昂贵，一般百姓难以承受；有的稳定性较差，保存条件要求较高，给用药者带来很多不便； 有的品种给药方式单一，只有口服、或只有静脉或肌肉注射，使用药范围受到很大限制。

蚯蚓在中药中统称为地龙，可分为双胸蚓、赤子爱胜蚓、锯齿远蚓及参环毛蚓等不同种 属，在我国早已被列入药源，其中作为活血化瘀应用已有几千年的历史。研究表明，新鲜的 蚯蚓体内含有多种蛋白酶类，其中一组具有强烈溶解纤维蛋白及血栓作用的丝氨酸蛋白酶由 日本Mihara等于八十年代首次发现，命名为蚓激酶，由此引起了国内外诸多学者的关注， 开始了对蚓激酶从分离纯化和理化性质到药效学研究与临床应用等方面的广泛研究。大量的 研究证实蚓激酶广泛存在于不同种属蚯蚓体内，是一组富含酸性氨基酸，分子量20000-40000 道尔顿，具有激酶和纤溶酶双重功能的丝氨酸蛋白酶：它既可类似纤溶酶直接降解纤维蛋白 及纤维蛋白原，又类似尿激酶、链激酶等激活纤溶酶原形成纤溶酶，起到纤溶酶原激活剂的 作用。蚓激酶的最大特点是稳定性好，纤溶活性强，药理作用明显，副作用小，可做成各种 剂型的药品，且来源广泛。近20多年来，不少的研究人员都在力求将蚓激酶的研究推向实际 应用，先后有各种各样的分离纯化技术问世。

如专利ZL 03134768.1公开了通过采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化， 从而得到高纯度蚓激酶。专利ZL02153848.4公开了通过粗分离先后过阴离子交换层析柱等精 细纯化工艺能得到七个组分可满足实验室规模制备。专利ZL03146692.3公开了采用包括阴离 子交换层析、超滤、凝胶过滤脱盐等分离方法获得达电泳级蛋白酶。上述种种蚓激酶分离纯 化方法都用到了柱层析技术，由于是粗提物直接上层析柱，所以柱子的负载量很大，相对于 等量的填料，蚓激酶的收率很低；且蚓激酶的制备成本很高，产生需处理的废液多；上述一 些工艺的蚓激酶的生产能力也相对较低。

直到目前为止，一些成熟的制备高纯度蚓激酶的实验技术真正转化为生产还有一定难度。 所以，研究开发一种蚓激酶生产工艺方法并实现其工业生产化成为科研工作者的当务之急。

为此，我们经过反复探索，开发研制了一种能实现工业生产化蚓激酶生产工艺方法。

这种蚓激酶生产工艺方法的优点在于：蚓激酶的收率较高、制备成本较低，产生需处理 的废液少、生产能力大。

经相关专利和现有技术文献检索结果显示，均未见本发明的蚓激酶生产工艺方法的相关 报道。

发明内容

为了克服现有的蚓激酶生产工艺存在的缺点：蚓激酶的收率低、制备成本高，产生需处 理的废液多、生产能力低，本发明提供了一种能实现工业生产化蚓激酶生产工艺方法。该种 工艺方法是在将蚯蚓匀浆时加入乙醇作为助剂并通过物理沉降、超滤去除杂蛋白，然后再上 柱子层析纯化，这样减少柱子的负载量，从而提高了蚓激酶的收率、降低了其制备成本，减 少了产生需处理的废液、大大提高了生产能力。

本发明的目的在于提供一种蚓激酶生产工艺方法。

本发明的任务是通过以下方案实施的。

一种蚓激酶生产工艺方法包括以下步骤：

(一)鲜蚓清洗

在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10～18小时， 让蚯蚓排出污物，用手或工具刮掉，称重。用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物， 用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用。

(二)磨浆

用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V)1∶3～5的比例加入低浓度乙醇的pH5.0～ 5.3的柠檬酸钠制成匀浆。

(三)除渣

用卧式螺旋沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液，粗渣集中处理。进料量 控制在100～300升/小时。料液中避免沙子进入，用完后用清水清洗。

(四)盐析

上清液中按30％饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。

(五)离心