[发明专利]一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种医学诊断用的方法，具体的说是一种检测卵巢癌组织中Legumain蛋白来判断卵巢癌是良性还是恶性以及预后的方法，该方法是通过免疫检测技术实现的，属于临床免疫诊断方法，特别是运用免疫组化方法检测Legumain蛋白从而判断卵巢癌是良性还是恶性以及预后的方法。

背景技术

卵巢癌是威胁妇女健康的重要恶性肿瘤疾病，其早期无典型症状及体征，目前临床如遇可疑情况都可借助于现代影像学检查和广义的肿瘤标记物检查及早作出诊断。在卵巢肿瘤中恶性卵巢肿瘤占25％，对其恶性程度的快速诊断可以对治疗产生积极的作用。

Legumain是一丝氨酸蛋白酶，是asparaginyl endopeptidase家族中的成员之一。它首先被证明在植物的种子芽苞形成中起着重要作用。进一步发现它也存在于寄生虫和哺乳动物细胞体内。然而近来我们发现Legumain在处于缺氧(Hypoxia)应激状态下极高的表达于肿瘤组织中，而在相应的正常组织中的表达极低或不表达。进一步我们还发现在肿瘤组织中，表达Legumain的TAMs在肿瘤新生血管细胞上高度表达，而非在培养的肿瘤细胞系中表达。而更为重要的是Legumain过度表达与肿瘤细胞的浸润和转移情况高度相关。通过对120例病例的临床观察研究发现，Legumain表达的高低与肿瘤患者的预后相关，即表达越高，恶性程度越强，预后越差(见表1)。

表1Legumain在卵巢肿瘤组织中表达情况的分析

恶性组VS交界组(χ²＝12.212，p＜0.05)；恶性组VS良性肿瘤组(χ²＝35.704，p＜0.01)；恶性组VS正常组(χ²＝45.500，p＜0.01)；交界组VS良性肿瘤组高于良性肿瘤组(χ²＝7.778，p＜0.05)；交界组VS正常组(χ²＝11.958，p＜0.05)；良性肿瘤组VS正常组(χ²＝10616，p＞0.05)。结果表明Legumain随着卵巢肿瘤转向恶性，表达量明显增强。

发明内容

针对上述情况，本发明通过免疫组化的方法检测病理组织中的Legumain分子，以此判断卵巢癌的预后。具体的讲就是，通过对病理组织的免疫组化反应，检测该组织中Legumain分子的表达数量，根据免疫组化反应的结果来判断卵巢癌的预后。

其技术内容包括：免疫组化反应和显微镜观察等步骤。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1.脱蜡和水化：

具体步骤如下：

①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟，

②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟，

③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟，

④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟，

⑤组织切片置于95％乙醇中浸泡10分钟，

⑥组织切片置于80％乙醇中浸泡10分钟，

⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟，

⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。

2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer(pH 6.0)通过微波炉，加热10分钟，放入组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。

3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。

4.将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。

5.用超纯水洗2次，各五分钟

6.滴加封闭液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。

7.滴加一抗(1∶100)50μL，室温静置1小时。

8.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。

9.滴加二抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。

10.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。

11.滴加三抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。

12.TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。

13.DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗10分钟。

14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。

15脱水、透明：

具体步骤如下：

①组织切片置于80％乙醇中浸泡30秒，

②95％乙醇中浸泡3分钟，

③无水乙醇中II浸泡5分钟，

④无水乙醇I浸泡5分钟，

⑤二甲苯II中浸泡5分钟，