[发明专利]一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法及应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种乳酸链球菌素(Nisin)修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备方 法，并将乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子用于农产品中致病菌的检测，属于纳 米材料及分析检测技术领域。

【背景技术】

果蔬和鲜肉类等食品在流通过程中，不可避免地受到微生物等不良因素的影 响，使食品感观、卫生指标恶化，食用安全性受到威胁。近年由于食用了大肠杆 菌污染的农产品以及炭疽杆菌感染的肉类食品所导致的食源性疾病的不断爆发， 食品因致病微生物污染引发的食源性中毒事件逐渐上升，中毒和死亡人数增加， 迫切地需要有效的方法能够快速、灵敏地检出微生物的污染。传统检测方法一般 需要对样品进行富集培养，使被检测微生物的数量在样品中达到检测的水平，测 定步骤较多，时间较长，发展更为快速的检测手段具有重要的意义。PCR技术虽 较传统的手段大有进步，但仍然有不足之处，如步骤较多，需要引物，速度还不 够快等。

已经证实纳米粒子和生物分子巧妙的结合能够应用于设计新型纳米传感器， 而且在生物医学应用方面也取得了巨大的进步。采用磁性纳米粒子实现对食源性 致病菌的检测具有检测速度快和对人为因素不敏感等优点，检测过程不需要富集 培养或复杂的PCR反应，其检测效率与传统方法相比具有明显的优势。

Nisin(乳酸链球菌素)是一种抗菌肽，常用作食品中的防腐剂，它是由34 个氨基酸残基组成，其N末端为异亮氨酸，C端为赖氨酸，在生理条件下带正电 荷。而且，抗菌肽Nisin与革兰氏阳性菌细胞壁的前体物质Lipid II上的焦磷酸酯 之间具有特异性相互作用。

本发明将Nisin通过共价键结合在Fe₃O₄磁性纳米粒子上，研究Nisin修饰的磁 性纳米粒子对食源性致病菌的吸附作用，并提供了一种快速、有效地检测致病菌 的方法。

【发明内容】

本发明的目的是克服通常情况下检测致病菌需要较长的富集培养时间、操作 繁琐、对人为因素敏感和检测效率低等缺点，提供一种Nisin修饰的磁性纳米粒 子的制备方法，并将其应用于农产品中的致病菌快速检测。

本发明的技术方案：

一种乳酸链球菌素修饰的磁性纳米粒子的制备方法，提供了Fe₃O₄磁性纳米 粒子制备条件及溶胶凝胶功能化条件，包括如下步骤：

(1)超顺磁性Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备

采用共沉淀方法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子：将FeCl₃·6H₂O和FeSO₄·7H₂O 分别溶于HCl溶液中，浓度均为1M，将两种溶液进行机械搅拌混合，通入氮气 保护，加入氨水，使溶液pH达到11，在室温下剧烈搅拌30min，以钕铁硼磁铁 进行磁分离，分别用高纯水、无水乙醇依次清洗各3次，60℃真空干燥12h；

(2)Fe₃O₄磁性纳米粒子的硅烷功能化

1)Fe₃O₄磁性纳米粒子包覆四乙氧基硅烷(TEOS)

将真空干燥后的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散于乙醇和水的体积比为1～50∶1 的乙醇水溶液中，超声混合，调节溶液的pH值为9，加入四乙氧基硅烷(TEOS)， 机械搅拌并氮气保护，室温反应(4～24)h，然后以钕铁硼磁铁进行磁分离，无 水乙醇清洗6次，60℃真空干燥12h；

2)硅包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子的氨基功能化

将真空干燥后的硅包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散混合有机溶液中，超声混 合，加入γ-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)混合均匀，在容器中机械搅拌并氮 气保护，室温24h，最后以钕铁硼磁铁分离，无水乙醇清洗6次，60℃真空干燥 12h；

3)氨基功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子的羧基功能化