[发明专利]携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途

说明书

本发明属于生物技术发明领域。是我们申报的中国专利“AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号：200910009059.6)”的延续和扩展。本发明具体涉及用携带了受miRNA调控表达Gluc基因的重组AAV病毒作为检测活细胞中miRNA活性的生物传感器，即“受miRNA调控表达Gluc基因的重组AAV病毒传感器”，其英文可表述为“rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor”。其中，“rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor”中所提及的“(Fluc)”是结构中所包含的内参基因元件。这种生物传感器检测活细胞中miRNA活性所使用的是AAV病毒反向感染技术。

rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的基因组的组成元件包括：

AAV ITR-(polyA-Fluc-PGK promoter)-Insulator-(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是Fluc的表达单元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是Gluc的表达单元；Gluc是hGluc(人源化的Gluc)，也可以使用天然的Gluc(Gaussia荧光素酶，Gaussia luciferase，Gluc)。

rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的作用是：探测活细胞中能与rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor所携带的miRNA靶序列(“miRNA靶序列”简写为“mirT”)相对应的miRNA的活性。

将已知的所有mirT分别置于Gluc基因与polyA之间，制备成一系列携带基于Gaussia荧光素酶基因的miRNA传感器，构成一个重组AAV病毒库(rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor库)。将该库中全部的或部分的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor按相同的Fluc表达效率有序包被在细胞培养支持物上(如96孔板或384孔板)，在无菌条件下制成可长期储存放置的重组AAV病毒阵列。

应用重组AAV病毒阵列时，将活细胞悬液加入预置了rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor阵列的细胞培养孔板中，重组AAV病毒将“反式感染”所加入的细胞，感染了这些病毒的细胞内的Gluc基因将表达并分泌到培养上清中；细胞内源性miRNA将特异性地和rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor中与之互补的mirT相结合，并对Gluc的表达产生不同程度的抑制作用。通过检测细胞培养上清中Gluc酶的活性，可以比较和计算出细胞内各种miRNA的活性水平。

背景

microRNA(miRNA)是长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。miRNA由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录产生。这些miRNA通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到达mRNA，进而产生miRNA阻遏翻译或引导miRNA对mRNA进行酶切的功能。

最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的miRNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30％的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过700多种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生和发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。