[发明专利]利用肠杆菌发酵生产2,3-丁二醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用葡萄糖为底物作为原料进行发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

2，3-丁二醇是一种重要的化工原料，广泛用于化工、食品、药品、原料以及航空航天等领域。2，3-丁二醇是无色至微黄透明稠状液体，其具有很高的价值，常用于增加酒的香气，使之醇甜、浓厚。在我国，2，3-丁二醇常被添加到白酒中，以改善白酒的风味；2，3-丁二醇其有低的凝固点(-60℃)，可以作为防冻剂；2，3-丁二醇和其他的液体燃料相比，其燃烧值高达27198J/g，因此可以作为液体原料来使用；由于2，3-丁二醇有很高的辛烷数，可以用作更高级燃料-航空燃料。除此之外，2，3-丁二醇还有一些特殊的性质：其通过催化脱氢可以转化成二乙酰，而该物质是一种高值的食品添加剂，能够改善食品的风味。酯化后的2，3-丁二醇可作为医药和化妆品的杀菌剂，0.1％的该溶液能够杀死大多数的病毒性细菌。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味。2，3-丁二醇还是一种具有旋光性的手性化合物，常被用来作为药物的载体，因此具有很高的医用和药用价值

2.3-丁二醇结构具有很高的特殊性，因此化学法合成2，3-丁二醇工艺过程复杂，而且成本较高，所以一直难以实现工业化大生产，因此目前生产2，3-丁二醇的方法主要是生物转化法。利用生物发酵方法生产2，3-丁二醇具有很大的优势，微生物在发酵过程中可用的底物十分广泛，即可利用常规底物，还可以利用各种废弃物进行发酵生产2，3-丁二醇。

发明内容

本发明的目的是提供肠杆菌进行厌氧发酵生产2，3-丁二醇的方法，2，3-丁二醇的产生完全是在厌氧或者兼性厌氧的条件下产生的，发酵液经过处理后即可得到纯净的2，3-丁二醇。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

(1)菌种：本发明以河底污泥为菌源，经过多次稀释后，从河底污泥中筛选出了一株能发酵生产2，3-丁二醇的菌种，经过经16S rDNA鉴定，该菌种和Enterobacter sp.Y5的同源性达到100％，应此可以确定该菌种为Enterobacter sp.Y5；

(2)底物：本发明主要采用葡萄糖，其他各种废弃物(如秸秆等)本菌种也可以利用；

(3)种子液体培养基：葡萄糖8～10g/L；蛋白胨3～5g/L；酵母粉2～4g/L；NaCl2～4g/L；K₂HPO₄0.5～1.5g/L；MgCl 0.2～0.4g/L；用浓磷酸将其pH调节到5.4～6.8；固体培养基：液体培养基+1.5％琼脂；

(4)发酵液培养基：葡萄糖18～24g/L；胰蛋白胨4～6g/L；牛肉膏2～4g/L；酵母粉1～2g/L；NaCl 3～5g/L；KH₂PO₄1～3g/L；MgSO₄0.1～0.3g/L；L-半胱氨酸0.3～1.0g/L；微量元素液(MnSO₄.7H₂O 0.01g/L，ZnSO₄.7H₂O0.05g/L，H₃BO₃0.01g/L，CaCl₂.2H₂O 0.01g/L，NaMoO₄0.01g/L，AlK(SO₄)₂0.01g/L)8～15mL；

(5)种子的活化：将菌种Enterobacter sp.Y5接一环到固体种子培养基上进行种子的活化，然后将活化好的种子转接到液体种子培养基上进行种子扩大化培养，用封口膜封好培养瓶，将其放置在30～38℃的摇床中进行种子的扩大化培养，摇床的转速为120～220rmp，培养8-10个小时。

(6)将步骤(5)中的种子液按装液量的4％～8％的接入到发酵反应瓶中，用硅胶塞塞好反应瓶。接完种后，向反应瓶中冲入0.2～0.5vvm的惰性气体(氩气或者氮气)，将反应装置放置在摇床中空气浴培养；培养条件为：30～38℃，转速为120～220rmp，培养时间为10～14小时，发酵液即为含有2，3-丁二醇的液体，发酵液经过处理后利用气相色谱FID检测器检测其中2，3-丁二醇的含量；

(7)对步骤(6)培养完后的发酵液进行离心、蒸馏、分离纯化等处理，可得到纯的2，3-丁二醇。