[发明专利]大口黑鲈溃疡综合症病毒聚合酶链式反应PCR检测法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对大口黑鲈溃疡综合症虹彩病毒特异的检测方法。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易起捕等特点，从上世纪七十年代开始推广到世界各地，目前全国大口黑鲈的年产在10万吨左右。但从2006年开始的每年6-10月期间，一种溃疡综合症在广东省的养殖大口黑鲈中流行，而且有逐年加重的趋势。感染该病毒的鱼发病时皮肤和肌肉溃烂，脾脏和肾脏变大，病鱼死亡率最高达60％，给养殖者造成了巨大的损失，已对大口黑鲈养殖产业构成了严重威胁。2008年，本单位的科研人员从病鱼中成功分离到一种病毒，经回归感染确认该病毒就是导致溃疡病的病源，经过电镜观察和DNA序列分析，确定了该病毒的分类地位是虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，命名为大口黑鲈溃疡综合症病毒。由于该病毒是新发现的病毒，对这种病毒病还没有有效的治疗方法，所以对该病的早期快速诊断，确定病原成为重要的防治手段，以减少生产上的损失。此外，该方法为苗种的检疫和评价提供了一个快速而可靠的方法。

水生病毒检测方法有生物学测定法、凝集试验、透射电镜观察法、酶联免疫反应、免疫组织化学、PCR检测等方法。生物学方法比较灵敏，但要花费2-3周的时间，不适合作病毒的快速检测与鉴定；凝集试验快速简便，但敏感性较差，应用不广；透射电镜观察法需要透射电镜设备，费时、费力，成本很高；酶联免疫反应检测快速，但需要有效的特异的抗体；免疫组织化学耗时，步骤繁琐，也需要有特异的抗体；PCR检测法具有特异、敏感、高效、快速、简便、重复性好和易自动化操作等突出的优点，已广泛应用于致病病毒的检测。大口黑鲈溃疡综合症病毒是本实验室新近发现、分离并鉴定的病毒，在分类地位上属于虹彩病毒科蛙病毒属，我们克隆并确定了该病毒的主要依壳蛋白MCP基因的碱基序列，GenBank登陆号为GU256635。1999年，Mao等人根据脊椎动物虹彩病毒主要依壳蛋白基因和DNA甲基转移酶基因的保守序列设计并合成引物，利用聚合酶链式反应(polymerasechain react ion，PCR)的方法有效地鉴定出虹彩病毒科蛙病毒属的病毒。但该方法还不能将大口黑鲈溃疡综合症病毒从蛙病毒属的其它病毒中区分开来。

发明内容

本发明目的是为了建立一种快速、准确、有效的在鱼发病早期特异性检测大口黑鲈溃疡病毒的方法，提出一种大口黑鲈溃疡综合症病毒聚合酶链式反应PCR检测法。通过比较包括大口黑鲈溃疡病毒在内的11种蛙病毒属的病毒的MCP基因，根据大口黑鲈溃疡病毒特异的基因序列设计引物，建立了快速、有效的能特异性鉴定大口黑鲈溃疡病毒的PCR方法。该PCR方法与荧光定量PCR相比，设备简单、成本低，有利于大量推广应用，但其灵敏度要稍低于荧光定量PCR。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种大口黑鲈溃疡综合症病毒聚合酶链式反应PCR检测法，步骤如下：

(1)、设计引物

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因序列和已知的虹彩病毒MCP基因序列比较结果，设计并合成引物如下：P1：5’-TCTGTTACGGGTTCTGGCATC-3’；P2：5’-CCAGCCAAGAGTTGAGCACAT-3’，预期扩增片段241bp；

(2)、提取模板DNA

1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

3)、重复步骤2)；

4)、再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

5)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

6)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE溶解DNA，4℃贮存备用；

(3)、PCR反应体系

ddH₂O                        20μL

10×PCR Buffer               2.5μL

4×dNTP(10mmol/L)            0.5μL

Taq酶(5U/μL)                0.2μL