[发明专利]大口黑鲈溃疡综合症病毒聚合酶链式反应PCR检测法

权利要求书

1.一种大口黑鲈溃疡综合症病毒聚合酶链式反应PCR检测法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：

(1)、设计引物

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列和已知的虹彩病毒MCP基因序列比较结果，设计并合成引物如下：P1：5’-TCTGTTACGGGTTCTGGCATC-3’；P2：5’-CCAGCCAAGAGTTGAGCACAT-3’，预期扩增片段241bp；

(2)、提取模板DNA

1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

3)、重复步骤2)；

4)、再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

5)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

6)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE溶解DNA，4℃贮存备用；

(3)、PCR反应体系

ddH₂O             20μL

10×PCR Buffer    2.5μL

4×dNTP(10mmol/L) 0.5μL

Taq酶(5U/μL)     0.2μL

P1(10μmol/L)     0.4μL

P2(10μmol/L)          0.4μL

模板DNA(0.3-0.5μg)    1.0μL

(4)、PCR反应条件

94℃预变性3分钟；  94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸20秒，30个循环反应，72℃延伸7分钟；

(5)、琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相，结果显示，30个循环反应可以检测到的质粒最小浓度是10⁴拷贝数/μL，35个循环反应可以检测到的质粒最小浓度是10³拷贝数/μL，分别以正常大口黑鲈、感染传染性脾肾坏死病毒的大口黑鲈和感染溃疡综合症病毒的大口黑鲈的脾脏组织DNA作为模板，进行PCR扩增以检测引物的特异性，结果仅大口黑鲈溃疡综合症病毒感染的病鱼组织能检测到扩增产物，而正常大口黑鲈和感染传染性脾肾坏死病毒的大口黑鲈均检测不到扩增产物。