[发明专利]一种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及青蟹养殖生物技术领域，尤其涉及一种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒。

背景技术

锯缘青蟹(Scylla serrata，学名为Mud crab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。

病毒是锯缘青蟹Mud crab养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失。2004年始在珠海发现患“嗜睡病”(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒：锯缘青蟹双顺反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)和呼肠孤病毒(mud crab reovirus，MCRV)。

MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80％以上。因此

对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养殖需要解决的重要问题。

目前，国内外医学上病毒水平的检测一般采用PCR、westen-blot、原位杂交和免疫组化等方法，但这些方法均存在着操作复杂、精确度不高、需要特殊的仪器、费时长并不适用于大样本检测等问题。

双抗体夹心ELISA方法是目前国际上普遍采用的定量检测细胞因子及其受体或者病原物的先进方法。双抗体夹心ELISA方法比生物学活性检测法具有更好的稳定性，特异性和灵敏度均较高，可以非常灵敏的检测出人与动物体液中细胞因子及其受体水平的变化以及病原微生物的表达水平，而且十分简便，不需要特殊的设备条件，利于推广使用。

目前，在水产动物病毒的检测上应用高亲和力单克隆抗体进行双抗体夹心ELISA免疫学快速诊断的研究鲜有报道，尤其是针对MCDV进行高亲和力单克隆抗体的研究，以及利用对MCDV具有高亲和力的单克隆抗体对MCDV进行双抗体夹心ELISA免疫学快速诊断的研究尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用MCDV结构蛋白的单克隆抗体，制备双抗体夹心，从而可对锯缘青蟹双顺反子病毒实现高效、灵敏、特异，且稳定性好的检测的方法。

本发明的另一个目的在于提供上述检测方法的专属检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

本发明人通过筛选制备分别得到锯缘青蟹双顺反子病毒三种结构蛋白的单克隆抗体，这三个单克隆抗体对锯缘青蟹双顺反子病毒具有很高的亲和力，在此基础上，本发明人又通过试验摸索和条件优化建立一种快速检测方法，该方法是基于双抗体夹心ELISA技术来检测锯缘青蟹双顺反子病毒的表达水平，从而实现对MCDV的快速检测。

本发明的详细过程如下所述：

一、MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体

为了实现本发明检测方法能够对锯缘青蟹双顺反子病毒进行高效、特异、灵敏，且稳定的检测，本发明人对锯缘青蟹双顺反子病毒进行研究，发现该病毒的三个结构蛋白，并分别得到这三个蛋白的单克隆抗体，用于本发明的检测方法中，具体步骤如下所示：

本发明人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV。

本发明人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两个开放读码框ORF1和ORF2，其中，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码结构蛋白。

本发明人对ORF2进行进一步地研究发现，ORF2由三个结构蛋白组成，分别是分子量为53KD的结构蛋白1(简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3(简称VP3)。

接着，本发明人对结构蛋白1、结构蛋白2和结构蛋白3进行了一系列的研究分析，如下所示：

1、氨基酸序列及其编码核苷酸序列

结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

编码结构蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

结构蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

编码结构蛋白2的核苷酸序列，如SEQ ID NO：4所示。

结构蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

编码结构蛋白3的核苷酸序列，如SEQ ID NO：7所示。

2、单克隆抗体的获得