[发明专利]SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，在临床样本中检测解脲支原体感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。 

背景技术

解脲支原体(ureaplasma urealyticum，UU)又称解脲脲原体，是一种原核微生物，为脲原体属中惟一的一种，因生长需要尿素而得名。解脲支原体可引起泌尿生殖道感染，与女性生殖道健康关系最为密切，被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体(占50％)的重要病原体。80％孕妇的生殖道内存在有解脲支原体。 

解脲支原体是人类泌尿生殖道常见的共生微生物，为致病性比较弱的条件致病病原体。在成人主要通过性接触传染，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道黏膜，女性感染部位在宫颈。妇女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了细胞免疫，机体抵抗力下降，更易受到解脲支原体的感染。主要引起非淋球菌性尿道炎(宫颈炎)、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、早产、前列腺炎、附睾炎、不育症、低体重新生儿、新生儿肺炎、脑膜炎以及败血症等。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。解脲支原体感染孕妇容易造成其流产，因此，对不明原因的流产，尤其是多次流产者，应考虑有解脲支原体感染的可能。解脲支原体感染造成的不完全梗阻的输卵管炎性粘连，可使管腔狭窄，通而不畅，还是发生宫外孕的重要原因。解脲支原体可以经胎盘垂直传播或由孕妇下生殖道感染上行扩散，引起宫内感染，两者均可导致流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、胎膜早破，甚至造成胎死宫内等一系列不良后果。 

解脲支原体基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，因其在培养基上的菌落呈针尖大小，菌体大小为0.2～0.3μm，须在低倍显微镜下观察，故又称之为微小(tiny strain)支原体，分子量4.5×10⁸，高度多形性，无细胞壁及前体，由三层蛋白质和脂质组成的膜样结构以及一层类似毛发结构组成，细胞器极少。在培养基上的菌落表面有粗糙颗粒，合适条件下可转成典型的“荷包蛋”样菌落。解脲支原体生长需要尿素和胆固醇，分解尿素为其典型的代谢特征，尿素分解后产生氨氮，使培养基pH上升。 

解脲支原体基因组亦为环状双股DNA，全长为200万～300万bp，G+C含量为25.5％。几乎所有ATP合成都是尿素水解的结果，产生一个产能的电化学梯度。解脲支原体不编码某些高度保守的eubacterial酶，包括细胞分裂蛋白FtsZ、Chaperonins GroES及GroEL和核糖核苷二磷酸还原酶，解脲支原体有6个密切相关的铁转运体，其是通过基因复制产生，提示其有一种在其他小基因组细菌所没有的呼吸系统。目前解脲支原体的1～14标准血清型可被划分为两大生物群，其一包括血清型1、3、6和14，称之为生物群1或Parvo，另一个则由其余各血清型组成，成为生物群2或T960。解脲支原体菌株的分群有助于阐明生物群或血清型与疾病之间的可能联系。 

目前市场上用于检测解脲支原体的方法主要有：分离培养方法，代谢抑制试验，间接血 凝试验，生长抑制试验，分子生物学诊断方法。分子生物学诊断方法目前主要应用聚合酶链反应(PCR)法及DNA探针技术作诊断。现在正得到广泛的应用。 

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。 

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针，SYBR Green法等，本方法涉及的是SYBR技术。其工作原理是：SYBR Green是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 

发明内容

为克服传统方法对UU检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低的检测产品。 

本发明提供了一种检测UU(解脲支原体)感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，包括阴性参考品、阳性对照品、荧光PCR反应液以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR分型引物。