[发明专利]一种用门多萨假单细胞菌株的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌株的分离纯化领域，特别涉及一种用门多萨假单细胞菌株的提取方法。

背景技术

自20世纪70年代以来，随着农村人口的快速增长和农村经济的不断发展，农业综合开发规模和乡镇工业对资源的利用强度日益扩大，使我国农村本来就已经短缺的资源和脆弱的生态环境面临着越来越大的压力。中国的区域和人口重点在农村，农村生态环境恶化趋势不从根本上扭转，将不仅严重影响和制约农业稳产增收、农民脱贫致富和农村现代化进程，使“三农问题”变成越来越难解的症结所在，而且也将直接影响我国社会经济可持续发展，严重威胁广大人民群众的身体健康，关乎食品安全和社会稳定。因此，加强农村生态环境保护不仅是当前农村经济社会发展中一项紧迫而又艰巨的任务，而且也成为我国新时期生态环境保持工作的重中之重。

微生物针对不同的污染物会分泌不同的酶参与反应，从而改变污染物的结构，降低其不利影响。本发明借助生物强化技术的思想，从农村生活污水中经驯化、富集分离、纯化后，得到一株高效脱氮降解的细菌。由于微生物对环境适应性强，且污染过程经历一段自然驯化期，因而可以通过驯化从自然环境中筛选到目的菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用门多萨假单细胞菌株的提取方法，该方法从农村生活污水的泥水中直接提取脱氮菌，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌种脱氮率可达90％以上，具有良好的应用前景。

本发明的一种用门多萨假单细胞菌株的提取方法，包括：

(1)提取驯化培养后的水样

从上海市崇明区农村生活污水处理工程生物净化槽-生态强化浮床中提取驯化了7个月后的泥水混合样；

(2)菌株的富集分离和纯化

将驯化了7个月后的泥水混合样静置30min，取上层水样1mL作10^-1～10^-10的梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到专性脱氮固体培养基进行富集纯化培养，确保长出单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，备用；

(3)菌株的筛选

将上述菌株按10％的接种量接种于无菌营养肉汤培养基中，于30～34℃、110～120r/min的条件下培养12～16小时，然后按20％接种量加入到筛选培养基进行唯一碳源的选择实验，最后通过NO₃-N的检测得到脱氮率为90.1％的菌株。

所述步骤(2)中的专性脱氮分离培养基为KNO₃2g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，蒸馏水1000ml，pH 7.2～7.4，乙酸钠50mmol/L；固体培养基需另加1.8％W/V的琼脂；

所述步骤(2)中的富集纯化培养是指将菌液于接种到专性固体培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株；

所述步骤(3)中无菌营养肉汤培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2，斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入4～6mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；

所述步骤(3)中的筛选培养基是以专性固氮培养基为基础，加入3g/L的乙酸钠、丙酸钠、乙醇、谷氨酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、甲醇、硫代硫酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠中的一种作为唯一碳源，调节pH至7.7。

所述的脱氮菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下：