[发明专利]一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属生物工程领域，涉及一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用。本发明还涉及该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的重组表达质粒和重组基因工程菌株。

背景技术

木质纤维素是自然界中丰富的可再生能源，由四种主要成份：纤维素(～33-51％)，半纤维素(～19-34％)，果胶(～2-20％)以及木质素(～20-30％)。木质纤维素降解产生可发酵的己糖(hexose)(葡萄糖，36～50％；甘露糖，0.3～12％；半乳糖，0.1～2.4％)和戊糖(pentose)(木糖，3.4～23％；阿拉伯糖，1.1～4.5％)。半纤维素的骨架结构是由β-1，4木聚糖，而木聚糖的降解酶主要由内切β-1，4-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和β-1，4-木糖苷酶(β-1，4-xylosidase，EC3.2.1.37)完成，。人们对木聚糖酶进行了系统的研究，但β-木糖苷酶却未得到足够重视。β-木糖苷酶是一种外切酶，以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。β-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分离得到。β-木糖苷酶是木聚糖降解的关键酶之一，有着重要的工业应用价值。在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶系转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在医药行业中，木聚糖酶系水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。例如，1998年Patel等人利用Moraxella.sp β-木糖苷酶水解10-去乙酰巴卡亭III木糖苷和10-去乙酰紫杉醇木糖苷7位木糖残基，得到重要的中间产物10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇，为紫杉醇的合成开辟了一条崭新的途径(Annu Rev Microbiol 52：95-361，1998)。

L-阿拉伯糖属于五碳醛糖，以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖体及类似于高等植物半纤维的形式存在。L-阿拉伯糖是一种没有热量的甜料，能抑制水解双糖的酶，抑制因摄入蔗糖而导致的血糖升高，因此可以抑制肥胖、预防并治疗与高血糖相关的疾病，已被美国食品药品监督局和日本厚生省批准列入健康食品添加剂。L-阿拉伯糖还可以用作医药中间体、用于生化领域中细菌培养基的制备以及香料合成等(化学与生物工程23：50-52，2006)。此外，L-阿拉伯糖可用于合成核苷类似物等抗病毒药物，治疗白血病、癌症的化疗药物等，据了解目前全球共有5种进入三期临床试验的抗乙肝新药，其中两种采用L-阿拉伯糖为原料(Antivir Ther.3：113-121，1998；Tetrahedron 65：1937-1949，2009)。L-阿拉伯糖的工业提取方法一般是采用碱提取植物中的半纤维素，然后酸水解工艺成本高，环境污染严重。因此，高效、节能、环保的生物转化方法生产L-阿拉伯糖成对我国的生物能源产业和功能糖产业都有非常重大的意义。随着国外对β-木糖苷酶的研究已日趋深入，发现一些β-木糖苷酶活还具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性，即双重活性。而国内相关研究仍然报道甚少，仅薛业敏等从嗜热厌氧菌Thermoanaerobacter ethanolicus中克隆到具有这一性质的酶Xar(食品与发酵工业29：22-26，2003)。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的具有木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能的糖苷水解酶。

本发明的另一目的是提供该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的制备方法。

本发明的再一目的是提供该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的应用。

本发明提供了一种木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。它的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了含有所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列的重组载体，该重组载体包括扩增载体和表达载体等。表达载体可以是例如大肠杆菌表达载体、酿酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体等常规表达载体。本发明还提供了含有上述的重组载体的重组菌株，该菌株的宿主细胞可以是大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、丝状真菌、昆虫或者哺乳动物细胞中等。