[发明专利]一种单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化方法。

背景技术

农产品和食品安全是一全球性问题，食源性疾病是食品安全的主要问题，近年来，国内外食源性疾病事件频频发生，而单增李斯特菌在食源性细菌中毒中占主要地位，李斯特菌属是最重要的人类食源性病原菌，是90年代食品中四大病原菌之一，在美国被列为7种主要的食源性致病菌之一。

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16％，有70％的人可短期带菌，4-8％的水产品、5-10％的奶及其产品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90％的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞(如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖。其毒力因子包括李斯特菌溶血素(Listeriolysion0，LLO)，ActA蛋白，磷脂酶C，P60蛋白，PrfA蛋白，内化素，表面蛋白P104。其中LLO是最主要的毒力因子，由hly基因编码的Hly蛋白，与破坏吞噬体，促进菌体进入胞液有关，是细菌得以在胞液内增殖的先决条件，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。不产生LLO的单增李斯特菌突变株虽可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，并且因无法逃逸吞噬体而不能对其他细胞的感染。除此之外，LLO还参与了同单增李斯特菌致病性有关的其它反应，研究显示：一单增李斯特菌感染鼠脾脏和骨髓的树突状细胞，可导致细胞的凋亡；不产生LLO的单增李斯特菌突变体不能诱导细胞的凋亡，而提纯的LLO则可引起这种程序性控可引起这种程序性控制的细胞死亡。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备单增李斯特溶血素O的原核表达及纯化方法，选取致病性李斯特菌主要毒力因子--溶血素O为对象，利用原核表达系统表达溶血素O蛋白，以亲合层析纯化表达产物，获得较高纯度的表达蛋白溶血素O。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种单增李斯特菌溶血素O的原核表达方法，包括以下步骤：

1)根据NCBI上登录的单增李斯特菌的基因序列，以及所要连接的载体PMD18-T的多克隆位点设计引物，进行PCR扩增、电泳和回收，并对该PCR回收物进行DNA连接反应；

2)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化；

3)碱法小量制备质粒DNA；

4)表达质粒的重组构建、重组菌的诱导表达。

所述引物序列如下：

正向引物Hly-F：5’-GCGTCGAC(SalI)CCAATTGCGCAACAAACTGA-3’

反向引物Hly-R：5’-CCCTCGAG(XhoI)TTTTGCGGAACCACCGTAA-3’。

所述大肠感受态细胞为E.coli DH5α和E.coilBL21(DE3)。

进一步的，通过Ni-NTA亲和层析进行表达蛋白纯化。

所述单增李斯特菌溶血素O蛋白的抗体在金标速测卡中的应用。

本发明是通过制备溶血素O的抗体在胶体金免疫技术中的应用来达到检测单增李斯特菌的目的。胶体金免疫技术，是90年代新兴的一种免疫学方法，现在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，显色程度与抗原含量成正比。

通过制备单增李斯特菌溶血素O蛋白进而获得抗体制作胶体金免疫层析试纸条，以便在食品检测中快速，准确的检测出单增李斯特菌。