[发明专利]蛋白质酶的微水介质固定化方法

说明书

技术领域

本发明属于酶的固定化领域，涉及一种用于固定化蛋白质酶的新方法，尤 其是涉及蛋白质酶的微水介质固定化方法。

背景技术

酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内进行其特有的 催化反应，并可回收及重复利用的技术。至今，固定化酶已经应用到异相生物 催化剂、专一性吸附剂、控制释放蛋白药物、分析检测仪、固相蛋白质化以及 能源开发等多个领域中。

目前最常用的固定化方法主要有4种：吸附法、共价交联法、交联法以及 包埋法。这些方法都各有优势和不足。自20世纪50年代至今，酶的共价交联 是酶固定化技术的重要手段之一。酶的共价交联固定化技术是指酶分子的非必 需基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价键实现不可逆结合的酶固 定方法，该方法固定的酶与载体连接牢固，不易发生脱落，有良好的稳定性及 可操作性，且使用寿命长，尤其在生物反应器的制备中发挥着重要的作用。但 该法反应剧烈，易引起酶构象的发生不可逆变化，严重影响了固定化酶的活力。

目前，提高固定化酶的酶活回收率，稳定性和使用性方面的方法大致有几 种：合适载体的选择，固定化条件的优化，以及各种抑制剂的添加(Improvement of enzyme activity，stability and selectivity via immobilization techniques.Enzyme Micro Technol，2007，NO.6)。这些方法都对固定化酶的效果起到了重要的作用。 这些技术基本上都是基于水相的条件下(即水介质条件下)进行的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有共价固定化技术的不足，从固定化所用介质出 发，提供一种新的蛋白质酶的固定化方法，即微水介质固定化方法，该方法能 够更好地保存酶活力，提高固定化酶的稳定性，比传统的水介质共价交联固定 化酶具有更大的优势。

本发明所述的一种蛋白质酶的微水介质固定化方法，包括以下步骤：

A.蛋白质酶的预处理：将拟固定化的蛋白质酶置于具备该蛋白质酶酶活 力的最适缓冲液条件的缓冲液中，冻干备用；

B.固定化载体的活化；

C.微水有机介质的制备；

D.将步骤A得到的蛋白质酶置于步骤C所制备的微水有机介质中，与步 骤B已活化的载体进行共价交联固定化，去除微水有机介质后，即得到微水介 质固定化酶。

根据本发明所述的蛋白质酶的微水介质固定化方法的进一步特征，所述的 步骤B中，是用交联剂对载体进行活化。

根据本发明所述的蛋白质酶的微水介质固定化方法的进一步特征，所述的 步骤C中，所采用的有机介质为非水溶性并能使所述的微水蛋白质酶在该溶剂 内仍可保持其活性的有机溶剂；将该有机溶剂制成含水量为0.4％～1.2％的微水 有机溶剂，即为固定化酶所使用的微水有机介质。

本发明所述的蛋白质酶的微水介质固定化方法，主要是利用有一定含水量 的微水有机溶剂把经预处理的微水蛋白质酶共价交联到载体上。因此，本发明 所述的蛋白质酶的微水介质共价交联固定化方法能够减少蛋白质酶在与载体进 行共价交联时因构象变化而导致的活力的下降，并提高固定化酶的稳定性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明所述的微水介质 固定化方法比传统的水相固定化方法能够更好地保存固定化酶的活力；(2)利 用本发明所述固定化方法得到的固定化酶与传统水介质中得到的固定化酶相 比，前者具有更高的稳定性；(3)本发明所述的蛋白质酶的微水介质固定化方 法，操作简单方便，便于应用。

本发明可应用于控释药物的研制，生物传感器的制备，功能多肽的固定化， 生物芯片的制作，生物反应器的制作，以及抗体的固定化等领域。

附图说明

图1为微水介质共价交联固定化辣根过氧化物酶与传统水介质共价交联固 定化辣根过氧化物酶的最佳温度的比较；图中，-□-表示微水介质固定化酶； -◆-表示水介质固定化酶。

图2为微水介质共价交联固定化辣根过氧化物酶与传统水介质共价交联固 定化辣根过氧化物酶的最佳pH的比较；图中，-□-表示微水介质固定化酶； -◆-表示水介质固定化酶。

图3为微水介质共价交联固定化辣根过氧化物酶与传统水介质共价交联固 定化辣根过氧化物酶的热稳定性的比较；图中，-□-表示微水介质固定化酶； -◆-表示水介质固定化酶。