[发明专利]TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及TOP2A mRNA表达检测液相芯片及检测方法。

背景技术

DNA拓扑酶II(Topo II)抑制剂药物是一类重要的化疗药物，主要有依托泊苷(etoposide)、开普拓、鬼臼噻吩苷、拓扑特肯等，其中，依托泊苷作为细胞周期特异性抗肿瘤Topo II抑制剂药物，主要用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病，对神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、非小细胞及小细胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定疗效。其抗癌机制是作用于DNA拓扑异构酶，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。DNA拓扑异构酶II是一种真核生物生存所必需的泛酶，在几乎所有DNA代谢过程中发挥重要作用。Topo II有IIα型和IIβ型两种，其中Topo IIα(又称TOP2A)在细胞快速增殖期含量最高，对多种肿瘤细胞系Topo IIαmRNA检测表明，Topo IIα在各种肿瘤组织广泛表达，无明显组织特异性。Topo II介导DNA解结或解旋，在DNA代谢的细胞生命过程中起重要作用。因为其重要生理功能，Topo II已成为抗癌药物的重要作用靶点。Topo II抑制剂通过直接作用Topo II或仅与双链DNA中的一条链结合以影响Topo II功能。研究表明Topo IIα酶活性的降低或表达水平降低都会造成Topo II抑制剂药物耐药。研究报道：高表达的Topo IIα使用依托泊苷效果较好，低表达的Topo IIα对依托泊苷药物耐药。检测TOP2AmRNA表达水平可以有效预测化疗药物依托泊苷的疗效。

作为TOP2A表达水平的参照物，持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。

基于以上基因的表达水平与化疗药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受化疗药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。

液相芯片技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，在微球的制造过程中，掺入不同比例的染色剂，从而形成100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的探针分子从而实现对多达100中待检物质的同步并行检测。因此，我们采用液相芯片技术可以同时检测多个基因的mRNA表达水平，实现了检测的高通量，大大提高了检测效率。

技术方案

本发明的目的之一是提供检测TOP2A mRNA表达水平的液相检测芯片。

实现上述目的的技术方案如下：

一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；