[发明专利]一种消减黄连自毒物质的微生物菌种筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物筛选方法，更具体的说涉及一种消减黄连自毒物质的微生物菌种筛选方法。

技术背景

黄连为我国大宗中药材品种之一，据记载，黄连的人工栽培历史已有600余年，黄连连作障碍形成及加重的原因复杂多样，各因素相互关联相互影响，是植物-土壤系统内多种因素综合作用的结果，包括土壤的传染性病害、理化性状劣变、植物化感物质等引起的自毒作用。现已认为植物化感自毒是导致植物连作障碍的主要因子之一。

植物化感作用是指一种活体植物(供体，Donor)产生并以挥发(Volatilization)、淋溶(Leaching)、分泌(Excretion)和分解(Decomposition)等方式向环境释放次生代谢物而影响邻近伴生植物(杂草等受体，Receiver)生长发育的化学生态学现象。受体和供体为同种植物时产生抑制作用的现象，为植物的化感自毒作用(Allelopathic autotoxicity)，即植物自身的分泌物，其茎、叶的淋溶物及残体分解产物所产生的有毒物质累积较多抑制根系生长，降低根系活性，改变土壤微生物区系的作用，这种作用有助于病原菌的繁殖，药用植物的连作障碍更为主要成因可能是自毒物质对植株产生的生理生化效应，自毒物质可能直接影响植株的光合效率、根系活力、保护酶活性、激素分泌及与其生长发育相关的信号物质的产生与转运以及控制次生代谢途径相关蛋白和酶的表达，从而影响植物的生长发育和次生物质的积累，导致产量和品质下降；同时自毒物质对土壤微生物群落具有趋化作用，造成有害病原菌增加和有益菌减少，导致病虫害频繁发生。虽然，生态控制，建立合理的轮作制度，构建复合群体，可以减缓药用植物连作障碍的影响。但是目前，还没有一种消除植物自毒作用的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种消减黄连自毒物质的微生物菌种筛选方法，具体步骤如下：

1)样品采集：用无菌土样袋采集4～5年植龄，长势健壮黄连的根际土壤；

2)增菌培养：将根际土壤放入20℃～25℃培养箱中培养5～7天，无菌水制成1％的悬浮液；

3)菌种筛选：将悬浮液采用划线接种PDA培养基平板中，并培养，培养温度18℃～25℃，培养时间5～7天；挑取不同形态的微生物菌丝纯化培养，将纯化的菌落移接于PDA斜面培养基中，1～5℃冰箱保存待用；

4)、消减效果评价：采用PDA培养基平板培养，实验组接种纯化菌种，对照组不接菌，18℃～25℃条件下培养7～8天，取样进行HPLC检测，选取消减效果最好的菌株，放大培养。

步骤4)HPLC检测条件为：用打孔器取10g菌饼，加入甲醇50ml，超声提取30min，补足重量，过滤检测。色谱柱为：C₁₈柱，4.6×250mm，5μm；流动相为：乙腈∶50mmol/L磷酸二氢钾溶液＝50∶50，加15mmol/L十二烷基硫酸钠，再以磷酸调节pH为4.0，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长345nm。

PDA培养基平板或PDA斜面培养基的配方为：水1000ml，200g马铃薯，10～20g葡萄糖，17-20g琼脂，10～15g黄连根茎粉末。

本发明的有益技术效果是：利用微生物消减黄连的自毒物质为减轻或克服黄连的连作障碍提供了一种新技术，具有成本低，适应性强，有效期长，消减率高等优点。将筛选出的菌株接种于连作地黄连根际，能明显促进黄连生长，降低病虫害的发生率；而对于黄连药材主要成分小檗碱、黄连碱、巴马汀等的含量无影响。

具体实施方式

利用微生物消减黄连的自毒物质为减轻或克服黄连的连作障碍提供了一种新技术，本发明提供一种消减黄连自毒物质，并适应黄连生产的微生物筛选菌种的筛选技术，具体体步骤如下：

1)、样品采集：用无菌土样袋采集4～5年植龄，长势健壮黄连的根际土壤。

2)、增菌培养：将土样放入20℃～25℃培养箱中培养5～7天。

3)、菌种分离筛选：采用PDA加黄连粉末培养基平板，每100ml培养基加入1g黄连根茎粉末；称取1g根际土壤加入99mL无菌水制成1％的悬浮液。对悬浮液采用划线培养，培养温度18℃～25℃，培养时间5～7天。挑取不同形态的微生物菌丝纯化培养，将纯化的菌落移接于PDA斜面培养基中，4℃冰箱保存待用。