[发明专利]一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒及制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及违禁药品的检测，属于生物技术领域，具体为一种去甲氯胺酮(NKET)的酶联免疫分析用测试盒及制备方法。

(二)背景技术

氯胺酮(Ketamine)，在我国俗称“K粉”，化学名为2-邻氯苯基-2-甲胺基-环己酮。试图以其替代苯环己哌啶(PCP)，消除PCP作为麻醉剂所产生的精神性副作用，而成为一种新型麻醉剂。氯胺酮是PCP的衍生物，于1962年首次人工合成，属非麻醉性镇痛药类。该药物在亚麻醉剂量时就能深度镇痛，而且没有大多数其它常规麻醉剂相关的抑制心脏、呼吸功能的副作用，已经在临床试用多年。

自1971年美国旧金山和洛杉矶市首先报告的氯胺酮滥用病例以来，氯胺酮滥用迅速蔓延至周边国家。上个世纪90年代末，氯胺酮滥用流入日本，泰国等亚洲国家，并迅速蔓延到我国。近二十年来，我国滥用氯胺酮的比例连续攀升，香港特别行政区尤为严重。鉴于氯胺酮滥用全球化的严重性，建立准确、灵敏的检测方法十分必要。

氯胺酮代谢较快，最初分布在脑和其他高灌流组织，然后分布到低灌流区。氯胺酮代谢的半衰期为3～4h，借助于细胞色素酶P450经N去甲基作用形成能产生与氯胺酮相同效果的去甲氯胺酮(norketamine)，去甲氯胺酮再进一步脱氢产生可能同样有活性的脱氢去甲氯胺酮(Dehydronorketamine)，见图1。氯胺酮和2种主要的代谢物又可进一步羟基化，形成葡萄糖酸结合物。氯胺酮及其代谢物90％经肾脏排泄，5％随粪便排除，4％以原形或去甲氯胺酮随尿排除。

图1氯胺酮及其代谢产物

在生物检材(如血液、尿液、毛发等)中代谢物的含量比较高，因此作为检测指标，氯胺酮代谢物(主要是去甲基氯胺酮)的检测比氯胺酮的检测更加重要，对是否吸食氯胺酮的确认也更加有效。目前主流的检测方法有气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS/GC-MS-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/LC-MS-MS)、毛细管电泳(CE)和薄层层析(TLC)等理化分析方法，同时亦建立了胶体金免疫层析(GICA)等免疫学检测方法。理化分析方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要昂贵的仪器设备，且耗时长。而胶体金免疫层析法使用的试纸条虽然克服了传统的仪器检测方法检测速度慢和不能进行高通量检测的弱点，而且无须专业人员操作，但检测限偏高。因此，本领域迫切需要一种能够更加快速、简易、灵敏地检测去甲氯胺酮的检测方法和检测试剂。

(三)发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒，其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了测试盒的制备及检测方法。

一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)标准品、抗NKET单克隆抗体和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。

一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制备、去甲氯胺酮(NKET)标准品的制备、抗NKET单克隆抗体的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。

其进一步特征在于：所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L pH9～10Na²CO₃-NaHCO₃的缓冲液作为包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀释至0.1μg/mL～1.0μg/mL，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH 7～8的磷酸盐缓冲液，2～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20～-40℃冷冻保存；

所述去甲氯胺酮标准品从去甲氯胺酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，NKET浓度为：0ng/mL～100ng/mL；