[发明专利]一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒及制备方法

权利要求书

1、一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)标准品、抗NKET单克隆抗体和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。

2、一种检测去甲氯胺酮(NKET)的ELISA测试盒的制备：其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制备、去甲氯胺酮(NKET)标准品的制备、抗NKET单克隆抗体的制备和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备。

3、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备：其特征在于：所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L pH9～10Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液作为包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀释至0.1μg/m L～1.0μg/m L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH 7～8的磷酸盐缓冲液，2～8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20～-40℃冷冻保存；

4、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备：其特征在于：所述去甲氯胺酮标准品从去甲氯胺酮纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，NKET浓度为：0ng/mL～100ng/mL。

5、根据权利要求2所述一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒的制备：其特征在于，所述抗NKET单克隆抗体的制备：50μgNKET-BSA偶联抗原用50μl生理盐水配成1μg/μl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂(液体石蜡∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混匀，充分乳化，供首次免疫用。加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂(液体石蜡∶羊毛脂＝12g∶20m1)代替完全福氏佐剂。首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为50μg/只小鼠。以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10μg/只。最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合。将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10∶1比例混合。离心，去除上清。在50～90S内将1ml 50％聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1min后加入20ml DEM培养液，终止融合。水浴静止10min后离心，去除上清。将融合细胞用含20％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×10⁴饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％CO₂，37℃条件下培养，8d后，每培养孔更换2/3HT培养液。10d～20d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆。杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行。以NKET-OVA为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照。阳性细胞孔的判定标准为(A_试验-A_空白)/(A_对照-A_空白)＞2.1。对分泌阳性抗体的细胞进行克隆。采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。对10～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×10⁵细胞/只。5d后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。