[发明专利]H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之人源化抗体，及其保守性变异体或活性片段，及应用该人源化抗体或片段用于预防与治疗的方法和用途。背景技术自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群暴发以来(Xu X et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)暴发，引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件，前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来，H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发，WHO及流感专家预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感暴发的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发，并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是，在泰国已经出现疑似人传染人事件，马来西亚也有多例报道。进入2005年，罗马尼亚、俄罗斯、土耳其等欧洲国家相继发现禽类感染H5型禽流感病毒致死事件，专家认为此乃带毒候鸟迁移的结果，这使得控制高致病性H5型禽流感病毒的进一步扩散传播变得更为困难。专家预测，随着侯鸟的传播，H5型禽流感病毒有可能通过欧亚、亚非大陆桥进一步传播到卫生条件极差的非洲国家，使得H5型禽流感病毒获得和其它人流感病毒充分重组的机会和时间，届时将很可能形成一种对人类高度致命的全新流感病毒，其给人类带来的各种损失将难以估计。根据WHO统计结果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人类个案已达80例，给全球公共卫生安全带来极大的考验。目前经过长期使用确定有效的两种的流感病毒治疗药物主要为两个类型：M2离子通道抑制剂金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，神经酰胺酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)(Monto，A.S.Vaccine，2003.21(16)：1796-800)。前两者以抑制病毒离子通道蛋白M2而发挥抗病毒效果；后者能选择性地抑制病毒表面神经氨酸酶的活性，阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制和释放，有效地预防感冒和缓解症状，使目前比较有效的抗流感病毒药物，但目前已不断发现新的H5N1病毒变异株对其有抗药性。这些药物如果在发病的最初2天内服用，将会缩短病程甚至拯救病人的生命。虽然离子通道抑制剂对于流感病毒的一些亚型十分有用(Dolin，R.etal.，N Engl J Med，1982.307(10)：580-4)，但是它却有很严重的副作用，并且病毒正在很快的进化出了耐药株(Shiraishi，K.et al.，JInfect Dis，2003，188(1)：57-61)，而且这些耐药株的传播性和致病性并没有减弱。感染过H5N1病毒而得到恢复的病人拥有在体外实验能中和病毒的抗体，提示抗体可作为治疗方法之一(de Jong，M.D.et al.，Nat Med.，2006，12：1203-1207)。在临床上，多克隆及单克隆抗体可有效地用于预防甲肝、乙肝、狂犬、呼吸道合胞病毒(RSV)感染(Sawyer，L.A.，Antiviral Res.，2000，47：57-77)。在1918年西班牙流感期间亦用人恢复期血清治疗，使流行期的死亡率下降了50％(Luke，T.C.etal.，Ann Intern Med.，2006，145：599-609)。我国SARS病人和H5N1感染病人的成功治疗经验，也发现利用病人恢复性血清能够很好的抑制病毒在体内的复制，从而使生命垂危的患者恢复健康。在小鼠动物模型中，H5N1特异的人源化鼠单抗、全人源单抗和F(ab’)2片段已被证明能有效地预防和治疗H5N1(Lu，J.et al.，Respir Res.，2006，7：43；Simmons，C.P.et al.，PLOS Medicine，2007，4(5)：928-936；Hanson，B.J.et al.，Respir Res.，2006，7：126)。高致病性禽流感病毒H5N1在受体结合位点的持续抗原突变即抗原漂变(antigenic drift)，对这些抗体的广谱抗病毒治疗能力提出了挑战。因此具有广谱中和能力的单抗的获得将成为H5N1治疗的希望，利用高质量的抗H5N1广谱中和性单抗治疗H5N1病毒感染患者可能会有抑制H5N1病毒在机体内的复制并获得理想的治疗效果，这是一种全新的抗病毒治疗方式。本实验室利用不同时间、不同地点、不同宿主分离到的多个禽流感病毒H5N1代表株免疫小鼠，持续进行单克隆抗体的制备，已制备出了包含400多株具有血凝抑制(HI)活性的H5特异性单克隆抗体的H5单抗库。根据对近千株全球各地H5N1病毒基因组序列进行的系统进化分析，我们筛选出34株不同地域、不同进化分支、不同宿主来源的H5N1代表株，加上2006年最新分离出的7个毒株共41个毒株组成代表性H5N1病毒库。对这41株H5N1病毒进行各单抗的HI活性测定，可根据HI活性的差异将这400多株单抗分为10个类型，同时可将这41株代表性病毒分为八个HI活性分支。初步筛选出17株单抗对2002以来的H5N1病毒株的抗原多样性进行分析。根据血凝抑制实验和细胞中和实验的结果，可将7种H5N1亚型分成4个抗原群。其中13D4、16F13等单抗均可对绝大部分毒株具有很高的中和活性，为治疗性抗体研究奠定了基础(Wu，W.L.，Chen，Y.，Wang，P.，Song，W.，Lau，S.Y.，Rayner，J.M.，Smith，G.J.，Webster，R.G.，Peiris，J.S.，Lin，T.，Xia，N.，Guan，Y.and Chen，H.2008，J Virol.82(4)，1798-1807)。