[发明专利]一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛型结核分枝杆菌抗体的检测试纸及其制备方法，特别是涉及一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，已报道的分枝杆菌有100多种。有关分枝杆菌的分类有很多，国际上通常将分枝杆菌分为典型结核分枝杆菌(tuberculosismycobacterium，TM)，和非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacterium，NTM)。TM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)，该群中DNA相关性约为85％～100％，分类地位相近；NTM指MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其它分枝杆菌。

结核是由MTBC中细菌引起的人畜共患传染病，近年来全球发病率逐年上升，特别是近年来发现由牛结核分枝杆菌引起的人类结核已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明，结核病牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境，因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。

牛结核病抗体检测的方法很多，例如：ELISA和免疫传感器技术等。但在实践中，这些方法的使用暴露出一些共同的劣势，例如：实验必须在专门的实验室中进行；需要电源和特殊的仪器；操作人员必须经过专门培训；实验系统不容易标准化，不容易在基层推广，为使结果可信，需要进行多次预试验和设立多项对照；试验操作步骤繁琐，至少需要2小时以上。

表面脂蛋白83(cell surface lipoprotein MPB83，MPB83)和主要分泌性免疫蛋白70(major secreted immunogenic protein mpb70，MPB70)是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原，并可在其中高水平表达(如MPB70可占牛结核分枝杆菌培养滤液蛋白的10％)，而在人型结核分枝杆菌H37Rv株中仅有少量产生，至今尚未证明MPB83在结核分枝杆菌复合群以外的分枝杆菌中存在。因此，MPB83和MPB70具有显著的种特异性。

MPB70编码基因大小约583bp，蛋白分子量约为22KDa，是感染动物体内T细胞识别的一种血清优势抗原，BCG接种牛的T细胞不识别MPB70。MPB83编码基因大小约603bp，蛋白分子量约为30KDa，是牛分枝杆菌的免疫主导蛋白，也是牛结核菌素的有效成分，能诱导很强的迟发型变态反应，刺激T淋巴细胞增殖和抗体产生。MPB70和MPB83的氨基酸序列具有61％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同的抗原决定簇。但与MPB70不同的是，MPB83是牛分枝杆菌表面相关性脂蛋白，其基因片段中含有一段典型的脂蛋白序列，并且在N端插有5个独特的氨基酸(Behr MR.et al.Mutations inMycobacterium tuberculosis Rv0444c，the gene encoding anti-SigK，explain highlevel expression of MPB70 and MPB83 in Mycobacterium bovis[J].Mol microbial2006，62(5)：1251-1263.)。

6Kda早期分泌性蛋白(6kDa early secretory antigenic target，ESXA)和10Kda培养滤液蛋白(10kDa culture filtrate antigen，ESXB)是近几年研究较多的两种结核分枝杆菌蛋白抗原，是存在于致病性结核分枝杆菌培养滤液中的早期分泌蛋白，均由BCG缺失的基因片段(RD1)所编码(Van pinxteren，Laurens A.H，et al.Diagnosisof Tuberculosis Based on the Two Specifi c Antigens ESAT-6and ESXB[J].Clinicaland diagnostic laboratory immunology，2000，7(2)：155-160)，序列有25％的同源性，诱导强烈的T淋巴细胞增殖活化和细胞因子分泌。

免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。