[发明专利]用质谱法高灵敏度定量肽

说明书

本申请是申请日为2003年10月2日，发明名称为“用质谱法高灵敏度定量肽”以及申请号为200380103688.6的分案申请。

发明技术领域及背景

本发明涉及用于对如人血浆等的复杂样品中的蛋白进行评价的定量分析。本发明可用于分析来自单一个体来源的样品，也可用于评价群体中特定蛋白质的水平，并可用于分析来自目标人群的集合样品。

需要对各种复杂蛋白质样品中(例如人血浆中)的蛋白质进行定量分析。通常，这些分析以免疫试验的方式进行，利用了相对于靶蛋白的特定抗体作为特异性试剂和检测试剂。新的方法，特别是涉及用同位素标记的肽进行内部标准化的方法，使得质谱法(MS)提供了这样的定量肽和蛋白质的分析(如现在MS用于测定低分子量药物代谢产物)。然而，当应用于非常复杂的混合物时，如那些自全血浆蛋白消化到肽的的复杂混合物时，存在着MS动态范围和试验敏感性的问题。本发明通过以下方式处理了这一问题：提供对敏感性的改进，及有效平衡了含有高量及低量蛋白质样品的消化液中监控肽的丰度，从而使得可同时测定复杂样品中的低量和高量蛋白。

能帮助扩增诊断学上有用的蛋白质组的一个重要的进展是同时将许多蛋白测定一起用作一个组，以便于将模式的改变与疾病或治疗关联，而不是依赖于单独解释的单个蛋白标记物。几种科研工作对该方法提供了数据支持。(参见Jellum、Bjornson、Nesbakken、Johansson和Wold，J Chromatogr 217：231-7，1981。)人们努力使用后一种方法在后标准化20种分析物的血清化学组中检测疾病标志物，但可能是由于该分析物的间接特性及其较少的数量，该努力收效甚微。

一段时间以来已建立了多变的蛋白质标记物的概念和使用方法。需要说明的是为什么该方法未曾有效进入到临床实践中去。

虽然蛋白质组学可显示并有时测定许多种蛋白质，现有技术(例如2D凝胶)已难于应用于大量足够大的样品来在研究水平上证明临床相关性。使用现有测验的另一方法对于确定检测组的疾病相关性通常太昂贵。在血浆的单个样品中全部可测得七十种蛋白，但使用单个试验的商业成本是$10896.30。这样最终，多分析物诊断的成功与科学工作的成本相同。

质谱法(MS)已解决了通过2D凝胶和其他方法溶解析的蛋白的鉴别问题，并也为复杂蛋白混合物的分析提供了显得稳定的通用方法。在以后的分类中，可区别两种通常的方法：第一，对样品中的蛋白质和肽经其检测或识别而获得“无偏见的”发现，及第二，对蛋白质或肽进行定量测定，通常需要某种额外的标准化物。

质谱技术发现复杂样品中蛋白质的能力依赖于存在通常源于DNA测序工作的大的蛋白质序列数据库，除了下述一种值得注意的例外。由于这些数据库越来越全面，至少在理论上该方法为蛋白质发现提供了一种通常的解决方案。到目前为止，MS工作已为蛋白质组问题审查了三种基本的窗口(window)：全蛋白质、通过体外消化蛋白(例如，用胰蛋白酶)获得的肽片段、及天然存在的肽(低分子量蛋白组或肽组)。

可用称为SELDI-TOF(为表面强化的激光解吸电离飞行时间)质谱的方法分析全蛋白质，该质谱法是MALDI-TOF(基质强化的激光解吸电离飞行时间质谱)的变体，在该方法中用基于对派生的MS靶的蛋白质亲和力的化学分级来将样品的复杂性降低至全蛋白MS可解析一系列单个峰的水平。该方法的严重缺点在于全蛋白MS分析不直接提供基于序列的识别(有许多蛋白质接近给定的质量)，因此没有其他有效的工作，严格意义上说未识别作为标志发现的蛋白质峰。尤其是，没有离散的识别，一般不可能说明一种峰是一个蛋白质分析物或将测定值转换为典型的免疫分析形式。然而，由于这已通过基于某些单克隆抗体的成功分析(其中靶蛋白质未识别)清楚显示，如果该技术允许该分析在任何目标实验室中重复(现在显示正在进行的工作)，此点不对临床使用造成重大限制。