[发明专利]共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物

说明书

1.发明领域

本发明涉及新的寡核苷酸衍生物。具体地讲，本发明涉及一个或多个小沟结合剂与寡核苷酸共价结合的寡核苷酸衍生物。这种寡核苷酸-小沟结合剂共轭物(以后称ODN-MGB)有较强的杂交能力，与单链或双链核酸的互补序列的结合力也较强。因此可用作序列特异的探针，并作为反义核酸和反义基因(anti-gene)治疗药物。

2.现有技术的简述

与双链DNA的小沟通过非共价键结合的小沟结合剂在本领域是已知的。能与双链DNA或RNA以非共价键结合的嵌入剂也是熟知的。这些嵌入剂一般属于平面芳香族化合物，它们嵌入(置身于)双链DNA或RNA的嘌呤和嘧啶碱基对之间。美国专利US 4835263描述了一种与嵌入基共价结合的寡核苷酸。这种携带有嵌入基的寡核苷酸可用作杂交探针。

本发明概述

本发明涉及寡核苷酸与小沟结合基共价结合的结合物。该结合物包括具有多个核苷酸单位、一个3′端、一个5′端的寡核苷酸和与至少一个所述的核苷酸共价结合的小沟结合基。小沟结合剂一般通过一条含有不超过15个原子的链即连接基与寡核苷酸相结合。小沟结合基是分子量为约150-2000道尔顿的分子基团，与双链DNA、RNA或杂合体的小沟以非嵌入方式连接，其缔合常数大于10³M^-1。

另一方面，本发明还涉及某些共价结合的寡核苷酸-小沟结合剂结合物的合成方法，以及该结合物用作核酸探针的方式及为有关分析和诊断以及治疗目的(作为反义核酸和反义基因)用的方式。

附图的简要描述

图1所示的是修饰的ODN或3’-ODN-CDPI₃轭合物与M13mp19(+)链DNA的狭缝印迹杂交分析的结果。下划线核苷酸表示与质粒靶序列错误配对的碱基。

本发明的详细描述

总的实施方案

本发明新结合物的显著特征是小沟结合剂与寡核苷酸共价结合，本专利申请的引言部分已经指出小沟结合剂是结合在双链DNA的小沟内的分子。但由于这类化合物的结构变化大，不能用一般通式来表示所有已知小沟结合剂的化学结构。能与DNA小沟结合的化合物一般都有月牙形的三维结构。现有技术中的大多数小沟结合剂都优先与B型双链DNA的A-T富含区结合。小沟结合剂或更准确地说本发明寡核苷酸-小沟结合剂轭合物的基团当然也优先与双链DNA的A-T富含区结合(本发明的寡核苷酸-小沟结合剂轭合物在下文中存时也称为ODN-MGB)。然而，优先与C-G(胞嘧啶和鸟嘌呤)富含区结合的在理论上也是可能存在的。因此含有这样的优先与C-G富含区结合的小沟结合基的ODN-MBG亦属本发明的范畴。已有的小沟结合剂优先与A-T区结合，可解释为鸟嘌呤(G)的2-位氨基与某些已知的小沟结合剂之间存在立体位阻。从下文的详述中可明显看出，在本发明的ODN-MBG中鸟嘌呤(G)被6-羟基嘌呤取代后，上述不利的立体位阻不复存在，ODN-MGB与互补链的结合力可能增强。

一般地讲，现有技术中已知的小沟结合剂一般不与双链RNA或DNA和RNA的双链杂合体结合。然而本发明的ODN-MGB却能够与单链RNA结合，上述性质是本发明的另一有趣的新方面。

根据本发明，能与ODN共价结合形成ODN-MGB轭合物的现有的小沟结合剂是一些天然产物如纺锤菌素、偏端霉素和lexitropsin、光辉霉素、色霉素A3、橄榄霉素、氨菌霉素、西伯利亚霉素和有关抗生素与合成衍生物。另一些双季铵杂环化合物、二芳基脒如戊烷脒、芪脒和berenil、cc-1065与有的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258、4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及许多由天然氨基酸或合成氨基酸构成的寡肽也是小沟结合剂。下列化合物的结构如下：

就本发明目的而言，如果一个分子能与双链DNA的小沟结合，其间的缔合常数为10³M^-1或更高，则该化合物就是小沟结合剂。这种结合可通过现有的光谱分析法如紫外光谱(U.V.)、核磁共振光谱(nmr)进行检测，还可利用凝胶电泳法。紫外光谱在有小沟结合剂连接时吸收峰移动，以及利用“奥佛赫塞”(NOSEY)效应的核磁共振光谱均是实现此目的有用技术。凝胶电泳则检测小沟结合剂与双链DNA或其片段的结合，因为该结合使双链DNA的迁移率发生了变化。