[发明专利]一种二价血红素肽铁的纯化方法及其用途

权利要求书

1.一种二价血红素肽铁的纯化方法，包括：

(1)  从畜禽血液中分离血红细胞，并加入抗凝剂处理；

(2)  分散血红细胞，并离心收集红细胞沉淀物；

(3)  超声波破壁血红细胞，释放出血红蛋白后，根据所用的降解酶调节pH；

(4)  添加降解酶溶液，并在真空室中将真空室内的真空度在1分钟时间内降至为0.01MPa，接通电源将真空室内的温度恒定为37℃，维持4小时，在真空和高频脉冲电场环境条件下，利用蛋白酶降解血红蛋白，释放二价血红素肽铁；

(5)  高温灭活酶后，离心收集上清液；

(6)  将上清液通过金属螯合亲和层析或电磁分离，纯化收集二价血红素肽铁；

其中，步骤4中是通过200kHz脉冲频率作用4小时进行高频脉冲处理，高频脉冲的电场参数为T₁-500.0us、T₂500.0us、Δ1.000ms、f1.000KHz、V₁1.88v、V₂-120mv、h20.3、脉冲波型为双向方波，电极间距为1.2cm，脉冲频率为200kHz；

其中，步骤6中电磁铁中心磁场为1.2T，磁场中心安装一根直径为5mm，长为200mm的玻璃柱，玻璃柱外围用130m长、直径为5um的含300种合金组成的不锈钢丝绕制成磁性玻璃柱，电磁分离所用的直流电源电流量不少于20A，电压不少于50V；

其中，步骤6中将血红蛋白降解液以40～120ml/h的流速均匀的沿管内壁自上往下流经电磁铁中心，回流处理3～4次，玻璃柱管与电磁铁中心横切面的角度为15°，接通电源，电流达到20A，当流出液达到20ml后，即可切断电源，解除电磁，用细胞分离缓冲液冲洗管内物质，即为二价血红素肽铁。

2.权利要求1的方法，其中步骤4中添加6000U/mL胰蛋白酶；步骤5中通过将真空度维持在0.01MPa、升高真空室温度至95℃、10-30分钟，以高温灭活酶。

3.权利要求2的方法，其中步骤1中使用0.2%柠檬酸三钠和0.15%的柠檬酸钠混合物作抗凝剂，按血液重量的5%添加到血液中。

4.权利要求2的方法，其中步骤2中按10%血液重量添加2%D-葡萄糖、0.85%NaCl、0.05%柠檬酸、0.08%柠檬酸钠，配制成细胞分散液，静置5分钟，在5000r/min转速离心30分钟，弃去上清液，收集沉淀物。 

5.权利要求3的方法，其中步骤3中使用胰蛋白酶则调节pH值至8.0，使用中性蛋白酶则调节pH至7.0，以防止血红蛋白中铁离子发生氧化反应。