[发明专利]生长激素融合蛋白

说明书

本发明涉及嵌合多肽，所述的多肽含有与生长激素受体的受体结合 区连接的经修饰的生长激素结合区；本发明还涉及所述修饰的生长激素 结合区的串连物/低聚物。

GH是一种与调节哺乳动物生长和发育有关的激素大家族中的一员。 人GH是一种22kDa的多肽，其与众多生物学过程有关，例如，细胞生 长，乳汁分泌，巨噬细胞活化以及能量新陈代谢调控。GH通过GH上称 为位点1和位点2的两个独立位点依次与膜结合的两个GHR反应。位点 1为高亲和性结合位点，而位点2为低亲和性位点。单独的GH分子通过 位点1与第一个GHR结合。随后第二个GHR通过位点2加入从而形成 GHR:GH:GHR复合体。该复合体随后被内化，并活化信号传导级联从而 导致基因表达改变。

GHR的胞外区存在两个相连区域，每个大约100个氨基酸(SD-100)。 其中C-末端SD-100区域(b)最接近细胞表面，而N-末端SD-100区域(a) 离得最远。一旦激素与形成的三聚复合体GHR-GH-GHR结合，这两个区 域的构象就会发生改变。

美国专利5849535公开了经修饰的GH，在此引为参考。对GH的该 修饰发生在位点1和位点2结合位点。对位点1的修饰产生出一种对GHR 亲和力高于野生型GH的GH分子，这种修饰的GH分子具有激动剂活性。 该文献还公开了对位点2的修饰，该修饰产生GH拮抗剂。美国专利US 5854026、US 6004931、US6022711、US6057292和US6136563公开修饰 GH而改变GH位点1的亲和力的其它例子，其中的每一篇在此均引为参 考。表1中列出了对位点1进行修饰的情况。对位点2的修饰也有公开， 特别是当将氨基酸残基G120修饰为精氨酸，赖氨酸，色氨酸，酪氨酸， 苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一种时，会产生一种具有拮抗特性的GH分 子。

此外，通过已知的“聚乙二醇化”方法将经修饰的GH包裹在聚乙烯乙 二醇(PEG)中能产生许多有益效果。首先，PEG包裹使GH的有效分子 量从22kD增大至大约40kD，这产生的效果降低了GH的血管小球滤过， 从而增加了GH在体内的半衰期，进而减少达到预期效果的给药剂量。此 外，认为聚乙二醇化既降低了用这种方式处理过的蛋白的免疫原性，还 降低了其毒性，参见Abuchowski et al J Biol Chem.，252，3578-3581， (1977)。

然而，聚乙二醇化降低了经修饰的GH分子对GHR的亲和性，这意 味着必须增加所需的剂量来克服亲和性的降低。由于它抵消了聚乙二醇 化带来的修饰GH的半衰期增加的有益效果，因此这种结果不尽人意。人 们期望获得一种经修饰的GH分子，该分子不需要聚乙二醇化，但也具有 增加的半衰期并具有降低的免疫原性和无毒性的附加优点。

本发明的第一方面提供了一种嵌合多肽，该多肽包括：

i)至少一个经修饰的生长激素结合区，其中所述的修饰为 插入、缺失或取代至少一个氨基酸残基；和

ii)生长激素受体的生长激素结合区。

在本发明的优选实施方案中，所述多肽在生长激素的位点1结合区 被修饰。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述多肽在生长激素的位点2 结合区被修饰。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述多肽在生长激素的位点1 和位点2被修饰。

如上文所述，位点1的突变是本领域公知的，其能提高生长激素与 生长激素受体上的其结合区的亲和性，这种修饰的生长激素作为促效剂。 如果位点1修饰与位点2修饰相结合，则后一修饰会使位点2结合位点 失活或部分失活，因此该分子作为拮抗剂。屏蔽掉野生型位点1结合位 点仅对位点2进行修饰也同样产生拮抗剂。

在本发明进一步的优选实施方案中提供了一种多肽，该多肽含有经 氨基酸取代修饰的位点1结合区，所述的修饰选自：对图12所示的序列 用丙氨酸或天门冬氨酸取代组氨酸18，用天门冬酰胺取代组氨酸21， 用丙氨酸取代谷酰胺22，用丙氨酸取代苯丙氨酸25，用丙氨酸取代天门 冬氨酸26，用丙氨酸取代谷酰胺29，用丙氨酸取代谷氨酸167，用丝氨 酸取代天门冬氨酸171，用丝氨酸或丙氨酸取代赖氨酸172和用酪氨酸取 代异亮氨酸179。