[发明专利]乳清蛋白的分离和测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳清蛋白的分离和测定方法。更具体地说，涉及一种能够高 效地将牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋白完全分离并定量测定的方法。

背景技术

一般牛乳中含2.2％～4.4％的蛋白质，主要为酪蛋白、乳清蛋白、脂肪球膜蛋 白等。乳清蛋白含量仅次于酪蛋白，占牛乳中蛋白质含量的18％～20％，其包括β -乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等及一些生长因子，其中β -乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分，约占其75％。因此，对牛乳和 牛乳制品中的乳清蛋白准确定量对于牛乳和牛乳制品的质量评价和控制具有重要 的意义。

现有的乳清蛋白的检测方法有：聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法(SDS-PAGE)、 毛细管凝胶电泳法(CGE)、高效液相色谱法(包括反相色谱法和凝胶色谱法)和 液相色谱质谱联用法(LC-MS)。

毛细管凝胶电泳(CGE)是将平板凝胶电泳在毛细管中实现。CGE分离变性 蛋白依赖于带不同负电荷的蛋白质在电场中迁移速度的不同得以实现，不需要染 色，蛋白的检测通过紫外吸收来完成定量检测。然而，CGE受到毛细管短、电压 等限制，不能很好地分离分子量差别很小的蛋白，同时灵敏度较低。聚丙烯酰胺 平板凝胶电泳法(SDS-PAGE)一直以来在生化领域被广泛应用于分离蛋白质、寡 核苷酸等生物大分子。它的定量是通过扫描经染色后的蛋白质在凝胶上的染色程 度来实现的。虽然该方法能够分离各种乳清蛋白，但其操作步骤复杂，检验周期 长，邻近带型的界面不清楚，不同批次间的染色和脱色存在误差，很难获得良好 的重现性，因此只能半定量，从而限制了其使用。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)采用紫外吸收来进行定量。但由于蛋白质 分子量一般都在万级以上，很多有亚基结构，立体构型及复杂构象，与流动相、 固定相及样品中的其它成分甚至蛋白质本身都可能存在多种复杂的相互作用，会 造成谱带扩散、峰形拖尾等问题，甚至发生变性和不可逆吸附，引起回收率和分 辨率降低，并且随着蛋白质体积和疏水性的增加，纯化难度也会增加。

凝胶色谱(GPC)是一种物理性分离方式。GPC分离蛋白依赖于不同分子量 的蛋白质在色谱柱中迁移速度不同而实现分离，不需要变性、染色，蛋白的检测 通过280nm的紫外吸收来实现，所以在蛋白的定量分析上更可靠。在乳清蛋白中， β-乳球蛋白(β-Lg)的分子量较α-乳白蛋白(α-La)大4000道尔顿左右，在 GPC中可以实现分离，并且运用紫外吸收来定量。但GPC受到分辨率低的限制， 不能同时很好地分离分子量差别较小的蛋白质，例如牛β-乳球蛋白(β-Lg)的两 个主要遗传变异体βb-乳球蛋白(βb-Lg)和βa-乳球蛋白(βa-Lg)的分子量分 别为18276.9道尔顿和18362.9道尔顿，两者仅差90道尔顿左右，因此无法通过 GPC进行有效分离。

液相色谱质谱联用技术(LC-MS)是近十年来兴起的新技术，与其他色谱方 法比起来具有更高的选择性和灵敏度。Czerwenka等采用LC-MS联用方法测定牛 乳和乳制品中β-牛乳球蛋白的含量，选用ESI(+)，全扫描的提取离子方式。但 Czerwenka等只测定了总的牛β-乳球蛋白含量，未涉及牛乳中α-乳白蛋白的分 离和定量(参见Christoph C.et al，Analytical Chemistry，2007，79(14)，5165-5172)。

因此，本领域需要一种能够高效将牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋 白完全分离并准确定量的方法。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种能够高效地将牛乳和乳制品中的未变性的α -乳白蛋白(牛α-La)和牛βa-乳球蛋白(βa-Lg)、牛βb-乳球蛋白(βb-Lg) 完全分离的方法和将分离出来的这些蛋白进行准确定量的方法。

本发明的乳清蛋白的分离方法包括：

对乳清蛋白进行预处理，

用以1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的超高效液相色谱柱将试样中 的牛α-乳白蛋白和牛βa-乳球蛋白、牛βb-乳球蛋白完全分离。

在上述分离方法中，作为所述以1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的 超高效液相色谱柱，优选采用ACQUITY UPLC BEH300 C18柱，并且以含三氟乙 酸的水和含三氟乙酸的乙腈溶液为流动相进行梯度分离。