[发明专利]两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发及应用

说明书

技术领域  本发明属于棉花育种领域，涉及两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁的新标记引物序列、特异序列和制备技术及应用。利用这些引物序列和特异序列进行棉花三系恢复基因的遗传鉴定、分子遗传连锁图构建和棉花恢复基因分子标记辅助育种，本发明公开了两个标记引物序列及扩增DNA片段序列。

背景技术  利用棉花细胞质雄性不育生产杂交种具有省工、省时和成本低等优点，因此“三系”配套生产棉花杂交种已成为一种必然趋势。目前国内外已经选育出了哈克尼西棉、三裂棉、异常棉、亚洲棉和陆地棉等不育系，其中哈克尼西棉、三裂棉和陆地棉的不育系实现了三系配套。已有研究表明哈克尼西棉不育胞质对杂种后代的产量有不利影响，在生产应用上没有取得实质性进展。2005年，本课题组首次研究培育出了第一个国家审定的比常规抗虫棉增产26.4％的三系杂交抗虫棉新品种，在生产上不但解决了棉铃虫的危害，而且促使棉花产量大幅度的提高。目前国内外报道了哈克尼西棉、三裂棉、104-7A和晋A不育系恢复基因的遗传连锁的分子标记。Guo等(1998年)使用RAPD-PCR技术分析(0-613-2R×Simian3)的BC₃回交群体中找到了一个与恢复基因紧密连锁的标记OPV-15300，并计算出与恢复基因的重组率为13.0±2.57％。Lan等(2001年)人同样也使用了RAPD-PCR技术，通过分析一对近等基因系HAF277(恢复系)和DELCOT277(CMS)，发现了1个与Rf连锁的RAPD标记UBC6592，其与Rf遗传距离为2.3cM；这个标记克隆测序后被定位到RFLP高密度图谱上，连锁分析表明这个标记与Rf基因的遗传距离为6.0cM。Liu等(2003年)使用BSA和GRA结合的方法，对陆地棉细胞质不育系和恢复系杂交F1代自交后的F2代群体进行RAPD和SSR筛选，结果找到3个SSR标记和2个RAPD标记与Rf₁紧密连锁，但与恢复基因Rf₁没有共分离，并使用非整倍体将Rf₁基因定位在第4条染色体的长臂上。Zhang(2001年)使用RAPD标 记和BSA分析CMS-D8恢复系，找到了与Rf₂紧密连锁的标记UBC111₃₀₀₀和UBC188₅₀₀，遗传连锁分析UBC188₅₀₀与Rf₂的平均遗传距离为2.9cM；并同另外两个标记UBC169₇₀₀和UBC659₁₅₀₀共同转化为STS标记。Feng C D等(2005年)使用RAPD和BSA技术分析(B416R×Ark8518)×Ark8518群体(恢复系B416R携带有D2-2染色体组上恢复基因Rf₁)，发现3个RAPD标记UBC147₁₄₀₀，UBC607₅₀₀和UBC679₇₀₀与Rf₁紧密连锁，其中UBC169₇₀₀和UBC169₈₀₀与Rf₁的遗传距离为4.5cM，UBC659₁₅₀₀距离Rf₁为2.7cM，并将其转化为STS标记。Yin等(2006年)在三个BC₁同交群体(不育系亲本的遗传来源为104-7A)中筛选了2250对SSR引物，找到5个新的与Rf₁基因紧密连锁的SSR标记，并将前人发表的3个STS标记整合构建了包含有13个与恢复基因相关标记的高精细分辨率遗传图谱，构建了恢复系的BAC文库，使用这些标记为探针从BAC文库中筛选到50个克隆，平均每个克隆的插入片段大小为120Kb，并将遗传图谱和物理图谱紧密联系起来，最终将Rf₁基因定位在两个BAC克隆重叠区域的100Kb之间。Wang等(2007年)人使用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR标记技术分析了(D8×SG747)×SG747群体，发现了三个新的RAPD标记UBC352₉₀₀、UBC683₅₀₀、UBC722₇₅₀和一个SSR标记CIR179₂₅₀，并将UBC722₇₅₀转化为CAPS标记，使用PPR基序设计的保守引物与AFLP组合测试回交群体得到一个PPR-AFLP标记与恢复基因Rf₂连锁，结合9个与Rf₂紧密连锁的分子标记构建了与Rf₂紧密连锁的遗传图谱；由于CIR179₂₅₀与Rf₂紧密连锁，同时又与Rf₁紧密连锁，并推测Rf₁和Rf₂都定位与D亚染色体组的LGD08连锁群上(现命名为D5染色体)。李朋波等(2007年)人对晋A衍生的不育系和恢复系组配的分离群体进行遗传和定位分析，表明‘晋A’恢复基因在F₂和BC₁的分离比例分别符合3∶1和1∶1，证明恢复基因由1对显性基因控制，用9个SSR标记和4个STS标记构建了长度为83.1cM的遗传图谱，将恢复基因Rf₁定位于第19染色体上(LGD08)与最近的标记CM042和CIR179分别相距5.4cM和10.3cM。而本课题组自主选育的抗虫三系杂交棉亲本P30A细胞质雄性不育系(胞质来源于104-7A)和Y18R恢复系(恢复基因来源于0-613-2R)的遗传背景 均不同于前四者，申请者首次构建了其恢复基因的遗传图谱，从棉花微卫星数据库搜索单一EST序列侧翼SSR引物，对棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记MGHES28；基于BAC克隆HZ-170-M6右末端序列设计STS引物，长度为505bp，对棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记STSHY27；并将两个新标记应用于恢复基因的分子鉴定。