[发明专利]一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法

权利要求书

1.一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

①在生物反应器加入0.5～2g大孔微载体，水化及灭菌后加入培养基50～100ml成纤维细胞培养基，加入成纤维细胞1×10⁶～10×10⁶个进行培养；

②待成纤维细胞贴附于微载体上后生长接近微载体表面积的50％时，抑制成纤维细胞的增殖，静置后倾去培养液；

③将上述得到的载体无菌无钙镁PBS冲洗后，加入表皮细胞培养基50～100ml及1×10⁶～10×10⁶个表皮细胞，继续搅拌培养，直至细胞长满载体，即可获得皮肤组织工程种子细胞。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：表皮细胞为角质细胞，同时含有黑素细胞及表皮内所含其它细胞的混合；优选的为表皮干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于表皮细胞的获取方法如下：

①选取小块健康皮肤，置于4℃的无菌PBS液中，用含有青霉素及链霉素PBS液反复冲洗后，剪除皮下脂肪组织，将皮肤置于碘伏或70～75％重量百分比浓度的酒精中消毒后，无钙、镁的PBS冲洗三遍，在无菌的培养皿中将皮肤切成小块，再置入0.5％重量百分比浓度中性蛋白酶中，4℃过夜；

②将经中性蛋白酶消化的皮肤置于培养皿中，加PBS以防止干燥，将表皮自真皮分离，37℃下将表皮置入0.25％重量百分比浓度胰酶和0.02％重量百分比浓度EDTA的混合液中消化15min，并不时摇动；

③加入与胰酶等体积的含10％重量百分比FCS的DMEM液终止消化，离心，重悬细胞，用细胞筛网过滤细胞悬液，即可得到表皮细胞。

4.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：成纤维细胞为人成纤维细胞或者经过增殖抑制的小鼠3T3细胞。

5.根据权利要求4所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：成纤维细胞的获取方法采用权利要求3所述的方法获取的真皮，通过0.05％胶原酶I 37℃消化4h，获得成纤维细胞。

6.根据权利要求3或5所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：健康皮肤选自患者自身健康皮肤或异体健康皮肤。

7.根据权利要求6所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：患者自身健康皮肤选用创面附近的皮肤，异体健康皮肤选用包皮环切术的包皮或整形术后余下的皮肤。

8.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：微载体为商品化的可降解大孔微载体，或者是使用可生物降解的材料，通过乳化-凝聚等方法并加用致孔剂制备的可生物降解的微载体。

9.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：抑制成纤维细胞的增殖的方法选用加入丝裂霉素C 10×10^-6/L或者通过亚致死量的Gamma辐照。

10.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于表皮细胞培养基为DMEM/F12重量比为3∶1的溶液，培养基中还包括以下的成份：

FCS  10～20％重量百分比         氢化考的松  5ng/mL

霍乱毒素  10^-10mol/L            胰岛素      5ng/mL

三碘甲状腺原氨酸  2×10^-7mol/L  腺嘌呤      1.8×10^-4mol/L

青霉素    100IU/ml              链霉素      100IU/ml

两性霉素B   0.25ug/ml           hEGF        10ng/ml

转铁蛋白    5ug/ml              谷氨酸      5ug/ml。