[发明专利]一种质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体内软骨组织再生支架的制备方法，尤其是质粒DNA/纤维 蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法。

背景技术

关节炎是临床上常见的疾病，由于关节炎或运动创伤所造成的关节软骨损 伤给许多病人带来痛苦。软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管，在损伤之 后不能形成纤维凝块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤 的部位，所以不易自行进行修复。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复 受损的软骨组织。应用再生医学的方法和原理来进行软骨组织的修复是目前的 一个重要手段，且取得了良好的效果。其中，软骨修复支架在软骨再生中起着 十分重要的作用。

人体的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量的细胞间质。 软骨细胞散在于软骨基质内的软骨陷窝内，陷窝周围的基质染色较深称为软骨 囊。幼稚的软骨细胞较小，常单个分布于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边 缘向中央软骨细胞的体积逐渐增大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。 幼小的软骨细胞可分裂，深部成熟的软骨细胞常2～8个成群分布。软骨细胞间 质的化学成分主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和少量的非胶原蛋白。软骨组织中 的胶原主要为II型胶原，占胶原总量的90％以上。II型胶原纤维在软骨内呈三 维网状分布，为关节软骨提供抗张强度。蛋白多糖通过连接蛋白以非共价键形 式与透明质酸结合形成巨大的蛋白多糖聚合体。蛋白多糖聚合体分子链上含有 丰富的负酸根离子，可以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹 性。水分占软骨组织全重的75％，其中含有大量正离子以平衡蛋白多糖分子中 的负电荷，并含有许多软骨细胞所需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内 无血管，但由于软骨基质富含水分，营养物质易于渗透，故软骨细胞仍能获得 必要的营养。

关节软骨具有极特殊的力学性能。例如关节软骨具有很好的弹性和韧性， 可承受较大的负荷，同时具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小。软骨 组织一旦缺损，将给患者带来巨大的痛苦和不便。在正常的关节中，关节软骨 紧紧与软骨下骨结合起来而不会剥离下来；当关节软骨受到压力时候，通过软 骨下骨将所承受的应力传递到骨，实际上是软骨下骨支撑关节软骨。研究表明， 关节炎常常会造成关节软骨和软骨下骨的同时病变，如果仅仅修复关节软骨， 而忽视软骨下骨的修复，常常会使得新生的关节软骨由于缺乏支撑而褪变。

软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细胞，损伤之后没有软骨细胞迁移生长 到损伤的软骨之中。而且，随着年龄的增长，软骨细胞的分裂能力逐渐降低， 产生细胞外基质的能力也随之降低。自体软骨细胞来源有限而且在体外培养增 殖过程中易去分化，而且仅仅只能在一定程度上修复软骨损伤，无法应用于骨 关节炎造成的骨软骨损伤。目前，来源于骨髓的间充质干细胞受到越来越多的 研究者和医生的重视。骨髓间充质干细胞容易获得，在一定的条件下能够向软 骨细胞和成骨细胞分化，不仅能够修复软骨损伤，而且能够同时修复骨软骨损 伤，因而被广泛地应用于临床前期的实验中。但是，干细胞的分化受到周围环 境和生长因子的调控，目前大多数的支架设计都是将生长因子负载于支架中， 希望负载的生长因子能够促进干细胞的定向分化；但生长因子价格昂贵，而且 易于失活，大量多次使用生长因子也会给宿主带来不良反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够模拟软骨的结构组成、促进骨髓间充质干细 胞向软骨细胞和成骨细胞分化进而促进骨、软骨组织修复和再生的质粒DNA/ 纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架及其制备方法。

本发明的质粒DNA/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法，其步骤 如下：

1)将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成1-10mg/mL的季铵化 壳聚糖溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌；质粒DNA配成100-1000μg/mL的水溶 液；将质粒DNA水溶液与季铵化壳聚糖溶液等体积混合，剧烈震荡混合均匀， 静置，制备得到质粒DNA复合粒子；

2)将纤维蛋白原粉末溶解于生理盐水中，配制成浓度为10-80mg/mL的纤维 蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制成浓度为10-20U/mL的凝血 酶氯化钙溶液；