[发明专利]一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法

说明书

所属技术领域

本发明属于疫苗的制备方法，主要是一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法。

背景技术

流行性乙型脑炎国际上统称日本脑炎，以往称日本乙型脑炎，在我国称流行性乙型脑炎(乙脑)。我国之前用鸡胚和鼠脑制成灭活疫苗，但鸡胚疫苗免疫原性差，而鼠脑疫苗由于含有较多的鼠脑组织成分，疫苗的副反应和免疫性不够满意，之后选用地鼠肾细胞培养病毒制备疫苗，不仅副反应轻，效果也较好。

目前上市的乙脑疫苗主要有活疫苗和死疫苗(即纯化疫苗)两类。活疫苗主要由培养SA₁₄-14-2减毒株生产，死疫苗主要由P3强毒株生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足，而提供一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明是提出以下技术方案实现的：这种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，步骤如下：

(1)、选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚处死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃±1℃培养3-4天；

(2)、选择细胞生长良好的细胞瓶，弃去培养液，用缓冲液冲洗去除小牛血清，缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶，冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃温室继续培养；

(3)、种毒16-18小时后进行换液，加入维持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃温室继续培养48-72小时；收获前检查细胞病变，选择细胞瓶内细胞病变75％以上的细胞瓶进行收集，将细胞瓶进行超声，使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内，摇匀即为病毒收获液；

(4)、病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心，流速为1500-2000ml/min，然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤，按1∶4000的重量比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活；

(5)、将病毒收获液浓缩60倍左右，通过凝胶柱层析，0.02M pH7.2的PBS洗脱，检测波长为280nm，收集第一峰，即为纯化后原液；用0.22um的膜除菌过滤，然后加入0.3-0.5％人血白蛋白作为保护剂，加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。

所述的病毒培养液包括：MEM培养液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6，经澄清过滤后加入终浓度为0.3％人血白蛋白制成。

本发明中的百分比均为重量百分比。

本发明的优点在于：1、用减毒株制备纯化疫苗安全性好。2、用β-丙内酯灭活病毒灭活效果好，灭活剂自然降解无残留。3、柱层析纯化性质温和，对病毒损伤小。

具体实施方式

下面结合实施例对发明作进一步说明：

本专利采用SA₁₄-14-2减毒株生产乙型脑炎纯化疫苗，为灭活疫苗。母株病毒为1954年分离自西安蚊幼虫的JEV SA14株，经动物神经外组织多次传代增殖提高免疫力的方法，最终获得毒力低而免疫性高的生产用毒株(SA₁₄-14-2)。SA₁₄-14-2减毒株对热稳定性高，在50℃加热2小时-4小时，病毒未完全灭活，与SA14原株无差别。其基因型也相当稳定，在地鼠肾细胞17代病毒中仍保持稳定不变。

本发明涉及流行性乙脑疫苗的方法，其步骤如下：

选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚处死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃±1℃培养3-4天。

细胞长满单层后接入毒种和培养液，毒种使用量为每100cm²细胞接种1ml毒种。病毒培养液主要包括：MEM培养液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6。经澄清过滤后加入终浓度为0.3％人血白蛋白制成。

选择细胞生长良好的细胞瓶，弃去培养液，用缓冲液冲洗去除小牛血清，缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶，冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃温室继续培养。

种毒16-18小时后进行换液，加入维持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃温室继续培养48-72小时。收获前检查细胞病变，选择细胞瓶内细胞病变75％以上的细胞瓶进行收集，将细胞瓶进行超声，使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内，摇匀即为病毒收获液。