[发明专利]一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)、选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚处死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃±1℃培养3-4天；

(2)、选择细胞生长良好的细胞瓶，弃去培养液，用缓冲液冲洗去除小牛血清，缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶，冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃温室继续培养；

(3)、种毒16-18小时后进行换液，加入维持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃温室继续培养48-72小时；收获前检查细胞病变，选择细胞瓶内细胞病变75％以上的细胞瓶进行收集，将细胞瓶进行超声，使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内，摇匀即为病毒收获液；

(4)、病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心，流速为1500-2000ml/min，然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤，按1∶4000的重量比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活；

(5)、将病毒收获液浓缩60倍左右，通过凝胶柱层析，0.02M pH7.2的PBS洗脱，检测波长为280nm，收集第一峰，即为纯化后原液；用0.22um的膜除菌过滤，然后加入0.3-0.5％人血白蛋白作为保护剂，加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。

2.根据权利要求1所述的流行性乙型脑炎疫苗的制备方法，其特征在于：所述的病毒培养液包括：MEM培养液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6，经澄清过滤后加入终浓度为0.3％人血白蛋白制成。