[发明专利]一种电泳用聚丙烯酰胺预制凝胶的缓冲系统

说明书

技术领域

本发明属于凝胶电泳技术领域，具体涉及用于预制胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲系统。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分及浓度，使之具有比较好的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种最常用的蛋白质分离和鉴定的电泳方法，被广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫学、临床化学、药学等学科的研究。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N′甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶具有由酰胺侧链的碳-碳聚合物形成的网状格子，没有或很少带有侧基离子，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。由于这种分子筛作用，在电泳过程中凝胶并不仅是单纯的支持物。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂释放自由基的速度。凝胶形成的孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械强度增强，当总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺(Bis)的浓度在5％(w/v)时孔径最小，高于或低于此值时，聚合体孔径都相对变大，凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它往往决定了电泳的分离效果。

常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳为不连续的电泳系统，采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和凝胶网孔，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。例如Laemmli缓冲系统((1970)Nature 227，680-686)，在分离凝胶中含有0.375mol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，用HCl滴定pH至8.8。浓缩凝胶含有0.125mol/L三羟基甲基氨基甲烷，用HCl滴定pH至6.8。阳极和阴极电泳缓冲液中含有0.024mol/L三羟基甲基氨基甲烷和0.192mol/L甘氨酸。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl-，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1％，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。大多数蛋白质pl在5.0左右，在pH8.8或6.8时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，由于其分子的大小不同而被分离成多个区带。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于三个主要因素：凝胶孔隙度的大小、它所带净电荷以及分子的大小和形状。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。目前常用的阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，由于它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可以用于测定蛋白质的分子量。为蛋白质分离和鉴定最常用的的电泳方法。

虽然聚丙烯酰胺凝胶电泳已经成为实验室的最常规实验方法，但其制备过程复杂而且耗时。需要准备的试剂多，工序繁琐，准备时间也长，而且每一次跑出来结果可能都不一样，造成实验效率低。因为丙烯酰胺具有神经毒性，且易造成环境污染及危害实验人员的健康。目前一些国外公司推出了多种电泳预制胶，预制胶因为是大规模生产的，所以胶与胶之间重复性好，不像手工灌胶那样结果差异大。且即开即用，不用再配制多种溶液、灌胶、等胶凝固，节省了宝贵的时间。