[发明专利]固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞及D(-)-酒石酸或其盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的制备方法，以及使用固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞制备D(-)-酒石酸或其盐的方法。

背景技术

D(-)-酒石酸，又名(2S，3S)-2，3-二羟丁烷-1，4-二羧酸，是天然L(+)-酒石酸的同型异构体，在自然界中极少存在，在制药行业中它主要作为手性合成的手性源及拆分剂。目前D(-)-酒石酸的需求量正在逐年递增，迫切需要提高产量，以满足国内外的需求。

当前生产D(-)-酒石酸的方法有：化学拆分法、生物拆分法、生物转化法。化学拆分法是指利用拆分剂实现DL-酒石酸分离得到D(-)-酒石酸和L(+)-酒石酸，但这类手性拆分剂价格昂贵，一次性拆分后对映体光学纯度和得率较低，且后续分离纯化工艺复杂，生产成本居高不下；生物拆分法是指利用特殊的微生物将DL-酒石酸中的L(+)-酒石酸耗竭而得到D(-)-酒石酸，但产物D(-)-酒石酸的得率最高只有50％，制备成本高；生物转化法是指利用微生物分泌表达的顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase，ESH)将顺式环氧琥珀酸或其盐催化水解为D(-)-酒石酸或其盐，它具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行，经济环保等特点，已成为D(-)-酒石酸生产技术的发展方向。

中国专利文献CN101481681A公开了利用重组技术构建基因工程菌pET22b-ESH-E.coli BL21(DE3)的方法。其中ESH酶基因(GenBank登记号为EU053208)来源于博得特氏菌BK-52(Bordetella sp.BK-52，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心；菌种保藏号为CGMCC No.2075；保藏日期：2007年6月11日)，将该ESH酶基因插入pET22b载体中，在大肠杆菌细胞中以胞内酶的形式实现了高效表达，这是生物转化法工业生产D(-)-酒石酸的重大突破。但是用游离细胞转化生产D(-)-酒石酸存在以下几个问题：

(1)基因工程菌细胞利用率低下。高顺式环氧琥珀酸水解酶活力的基因工程菌细胞只能使用一次，成本高，污染大。

(2)基因工程菌细胞的顺式环氧琥珀酸水解酶活力偏低，一般为3278U/g。由于顺式环氧琥珀酸水解酶属于胞内酶，与底物接触的机会受制于细胞膜的通透性，导致其催化活性的降低。

(3)产物杂质多。在利用游离基因工程菌细胞催化顺式环氧琥珀酸或其盐生成D(-)-酒石酸或其盐的反应体系中存留有大量的菌体、蛋白等杂质，增加了后续产物分离纯化工艺的负担。

固定化微生物细胞是20世纪60年代酶学领域崛起的新技术，在化工、医药、发酵、能源、食品等行业中实际运用效果显著。它是利用化学或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，以利于细胞内的一种酶或多种酶进行生物催化，并保持细胞活性，可反复使用的一种技术。与传统游离细胞相比，固定化细胞有如下优点：单位体积的菌体密度高、菌体易回收、酶活力高等。但目前国内外还没有关于固定化细胞生产D(-)-酒石酸的报道。因此利用细胞固定化技术生产D(-)-酒石酸具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的方法，用以提高细胞内顺式环氧琥珀酸水解酶活力和细胞使用率。

本发明的另一个目的是提供一种使用上述固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞生产D(-)-酒石酸或其盐的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了如下固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的方法：在κ-卡拉胶溶液中加入顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞充分混合均匀，将上述混合溶液冷却直至充分凝固后再在氯化钾溶液中固定，然后将凝胶取出切成小块，依次用蒸馏水和生理盐水洗涤。

进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞为pET-ESH-E.coli，该基因工程菌细胞与所述κ-卡拉胶溶液在42-45℃的条件下均匀混合，冷却温度为4-10℃，所述氯化钾溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，所述固定的温度为4-10℃，固定的时间为4-16h。

进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞与κ-卡拉胶溶液在42℃的条件下均匀混合，冷却温度为4℃，所述氯化钾溶液的浓度为0.3mol/L，所述固定的温度为4℃，固定的时间为10h。