[发明专利]在微阵列上检测未指定的遗传修饰生物体

说明书

发明领域

本发明属于诊断领域，并涉及一种包括用于检测可能存在于样品中的未指定的遗传修饰生物体(GMO)，如植物、动物、细菌和/或酵母的试剂和工具的方法和试剂盒。

本发明特别适于在某些国家当条例仅仅批准有限数量的一些指定GMO存在于它们的市场中时，在食品控制中辨别批准的与未批准的GMO的存在。

发明背景

生物芯片技术的开发，允许同时检测给定样品中存在的多种和特异性核苷酸序列，从而允许鉴定从其中获得这些序列的相应生物体或生物体的部分。微阵列是固相支持体，其表面包含一系列分立的区域，这些区域带有捕获多核苷酸序列(或捕获探针)，其能与可能存在于待分析样品中的相应靶核苷酸序列结合(通过杂交)。它们的检测必须结合它们的遗传扩增如PCR完成。

本发明利用了用于检测未指定GMO的多参数分析所提供的可能性。

技术现状

微阵列是非常适于蛋白质和多核苷酸序列的多参数检测。待分析的物质通常以极低的量存在于样品中，而且遗传物质的检测首先需要被扩增。在遗传扩增方法当中，PCR是最常见的一种。对于在固定的捕获分子上检测的扩增序列(扩增子)的困难是，它们是双链的，并因此在溶液中非常快的再聚集，以致难以获得它们鉴定的信号和可能的它们的定量。专利US 7,205,104和US 7,202,026中解决并呈现了这个问题。存在其他的策略，其基于利用单链序列或扩增序列的破碎，参见WO 97/29212和WO 98/28444。

GMO的检测需要联合PCR扩增与微阵列检测技术。

GMO根据定义包含转化事件，后者通常指插入核酸构建体或盒到受体生物体中。这个基因构建体由几个遗传元件组成，通常至少一个目的基因，一个作为起始信号发挥作用的启动子，和一个作为停止信号发挥作用的终止子，用于基因表达的调节。而且，构建体的邻侧可以是来自克隆载体的DNA序列。大多数遗传修饰的(GM)植物，已经用包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(P-35S)和/或CaMV 35S终止子(T-35S)和/或根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶终止子(T-Nos)的构建体转化。最常使用的克隆载体，是包含编码抗氨苄青霉素(bla)抗生素的基因的pBR322，或包含编码抗新霉素/卡那霉素(nptII)抗生素的基因的载体。

几个国家有用于GMO和用于GM来源的食品组合物的强制标记条例。特别地，欧盟条例确定了食品和饲料的强制标记，用于追踪食品中GMO，该食品和饲料由比例高于食品组分0.9％的遗传修饰生物体(GMO)组成，或包含比例高于食品组分0.9％的遗传修饰生物体(GMO)(条例EC第1829/2003和1830/2003)。EU批准的GMO的目录公布于网址

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm，而且新的GMO的应用已经向EU管理行政部门提出等待批准(http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm)。该条例涉及的GMO的数目随时间而变化：1999年批准12种GMO，2006年20种，2007年24种。该目录中不存在的GMO认为是未批准的。EU条例要求，对于一种待批准的GMO，由公司提供一种测试方法。因此当一种GMO被接受时，批准的GMOS的特异性测试的信息是公众可获得的。对于未批准的GMO，信息通常是不可得到的，这就是为什么它们有时列为未知GMO(或未指定GMO)的原因。

其他的国家如日本、台湾和南韩，已经确定了5％的阈值。南美国家如巴西采取一个阈值来标记包含超过4％GMO的所有产品。一些国家象澳大利亚和新西兰，也需要用于GMO的食品标记。

为了遵守对那些条例的国家和欧洲要求，而且通过准确的信息向消费者允诺选择自由，CRL Community Reference laboratory(CRL)与GMO实验室或ENGL的欧洲网络合作已经描述了并证实了几种GMO分析方法(http://gmocrl.jrc.it/statusofdoss.htm)。

GMO测试可能限于一种简单的筛选PCR，其通常在GMO中常发现的一些遗传元件如P35S或T-Nos上进行。然而，特异性鉴定和定量需要遵守条例和标记的要求。每个GMO的个别检测，变得困难而且昂贵，特别是因为待检测的GMO的数目正在持续增加。