[发明专利]快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测领域。更具体地，本发明涉及通过酶联免疫斑点显色和自动扫描仪器，对人肠道病毒中和抗体进行检测的方法和试剂盒。

背景技术

人肠道病毒(Human Enterovirus，EV)包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(entericcytopathogenic human orphan virus，ECHO)和新肠道病毒(Enterovirus 68-71型及73-102型)，其引发的由呼吸系统疾病到中枢神经系统的多种疾病给人类健康带来极大威胁和严重危害，尤其是新肠道病毒EV71引起的手足口病，发病率和死亡率近年呈逐年上升趋势。因此，开发快速的诊断试剂与安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。人肠道病毒疫苗研究开发的最重要的指标是人肠道病毒的中和抗体水平，因此建立准确和简便的中和抗体检测方法非常重要。EV大多具有严格的宿主特异性，在体外对EV进行快速高效的组织培养比较困难，并且缺乏合适的动物模型。因此亟待探索开发可及时鉴定或筛选中和抗体和评价疫苗有效性的方法。

到目前为止，已有多种EV中和抗体检测方法，如基于补体结合试验(CFT)的检测方法(Kraft，LM等，实验医学杂志，1950年，92卷：483-497页)、基于间接免疫荧光(IFA)的检测方法(Macwilliam，KM等，临床病理学杂志，1974年，27卷，825-827页)、基于传统中和实验(NT)的检测方法(Melnick，JL等，美国公共卫生协会，1979年，5卷，471-534页)、基于酶联免疫吸附法(ELISA)的检测方法(Bidwell，DE等，Bull.WHO，1976年，54卷，129-139页)等。其中，CFT操作繁杂，影响结果判定的因素较多，且补体结合抗体的特异性较低，因此现在很少使用；IFA虽然特异性较高，但敏感性较低且结果判定受主观因素影响，分析自动化困难，难以满足快速高效筛选中和抗体的需求。

当前检测EV中和抗体的方法主要有两种：(一)NT：是将抗体样品与病毒作用后感染细胞，连续7至10天观察细胞病变情况，再通过肉眼观察并采用CCID50或TCID50方法计算病毒效价，进而评估EV中和抗体对病毒感染的阻断能力；(二)ELISA：一般采用间接ELISA，利用包被的病毒或重组抗原，与为中和抗体的抗体样品结合，再结合生物素标记的第二抗体，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，再用酶标分析仪获得结果，进而评估EV中和抗体的中和效果。但在实际应用中，上述方法前者实验周期较长，工作量大，人工判定也存在主观误差问题，难于满足快速、高通量的筛选需求；后者敏感性较高，可用于自动化分析，结果判断比较客观，但其特异性取决于抗原制备，不能用于准确检测中和抗体。

因而，本领域迫切需要建立改进的中和抗体检测方法。本发明满足了这一需要和其它需要。

发明概述

本发明的一个目的是提供改进的病毒中和抗体检测方法。优选地，本发明方法具有简单、有效、和/或快速的特点，更优选本发明方法适于进行高通量的检测病毒(特别是肠道病毒)中和抗体。在一个优选实施方案中，本发明结合了酶联免疫斑点显色和斑点扫描仪器，使被病毒特别是人肠道病毒感染的细胞带有区别于正常细胞的标记信号(如颜色信号)，并应用斑点扫描仪器扫描检测斑点的数量来实现对被人肠道病毒感染的细胞的检测，从而构建一种新型高效的用于检测人肠道病毒中和抗体的模式，并将这种模式应用于检测人肠道病毒中和抗体的方法。

常规的酶联免疫斑点法(ELISPOT)(Sedgwick JD，分子生物学方法杂志，2005年，302卷，3-14页)是通过显微镜或ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点进行分析获得结果的一种方法。它是从单细胞水平检测分泌细胞因子(CK)的细胞或分泌抗体的细胞(ASC)，而本发明(即新酶联免疫斑点法)则是从单细胞水平检测感染病毒的细胞，从而间接反映单克隆抗体对病毒感染的阻断能力，最终评判中和抗体的中和效果。