[发明专利]一种新型畜用肽苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽用口蹄疫化学合成肽疫苗及其制备方法。 

背景技术

口蹄疫(foot and mouth disease，简称FMD)是偶蹄动物的一种高度接触性、发热性、急性传染病，在世界各国普遍分布。其传播迅速，感染马、牛，猪，羊等牲畜，导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，口蹄疫在许多国家已经被消灭或很好地被控制，然而近几年，它再度给养殖业带来巨大的经济损失。1997年我国台湾口蹄疫大爆发，殃及600多个猪场，2000年在俄罗斯爆发造成了巨大的经济损失。2001年2月在英国的爆发和流行，给英国养殖业造成了继疯牛病和猪瘟两大疫情损害后的又一次沉重打击，其影响甚至扩展到整个欧洲。在我国，A型FMDV、O型FMDV、AsiaI型FMDV都有发生，AsiaI型FMDV在历史上仅局限于我国云南边境地区流行，但在2004-2006年先后在我国新疆、甘肃、江苏、北京、河南等地爆发了AsiaI型口蹄疫，严重影响当地畜牧业的发展。 

口蹄疫病毒(FMDV)属于细小核糖核酸病毒，该属的病毒具有多型性、易变性等特点。全世界有A、O、C、Sat1、Sat2、Sat3和AsiaI7个血清型，亚型有70多个，各血清型间不存在交叉免疫，且病毒易发生变异，这就为FMD的防治造成了很大困难。目前，我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，但灭活却存在许多隐患，如疫苗生产过程中由于不慎易引起病毒的逃逸以及灭活不完全而导致FMD的再度暴发，不同型的毒株间不能提供有效保护等。目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。为了克服灭活疫苗的自身不足，FMD各种新型疫苗如可饲基因工程疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等不断涌现，但是其在安全性、免疫效果、工艺方面都存在诸多问题，影 响了这些新型疫苗的使用。 

研究表明：口蹄疫病毒衣壳蛋白由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个组成，VP1-VP3位于衣壳蛋白的外侧，组成衣壳蛋白亚单位，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，其上含有FMDV主要抗原结合位点能诱导机体产生中和抗体，研究表明，位于VP1第134-158氨基酸之间的G-H环，C端第200-213氨基酸残基是诱导中和抗体的主要免疫抗原位点。在本发明中，选择了O型、A型和AsiaI型FMDV结构蛋白VP1上第130-168位的优势B细胞表位。同时由于口蹄疫主要以体液免疫为主，有效的疫苗应该能诱导以Th2为主导的免疫反应。DiMarchi等曾报道，将串联有FMDV VP1第140-160和第200-213氨基酸残基的合成肽免疫牛后，动物能抵抗病毒的感染。但随后的研究证实，当将此类合成肽疫苗在易感动物群内大规模使用时，却仅能提供有限的保护。究其原因，强效T细胞表位的缺乏可能是影响该疫苗效果的一个因素。同时携带B细胞抗原表位和T细胞抗原表位的串联肽已经被证明对牛表现出良好的免疫反应性。研究证实，在FMDV衣壳蛋白上有多个能被牛和猪淋巴细胞识别的T细胞表位，但对这些T细胞表位的识别明显地受到了宿主MHC多态性的限制，进而也限制了它们在疫苗中的应用。同时研究发现，内源性的T细胞表位不足以刺激易感动物免疫系统对口蹄疫病毒产生有效的保护。所以，提供强效的外源T细胞表位以辅助增强易感动物的免疫应答是研究高效肽苗的关键。 

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种能抵抗口蹄疫病毒感染的肽疫苗。 

本发明的另一个目的是提供一种生产上述肽疫苗的方法。 

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案： 

本发明提供一种抗口蹄疫病毒的肽疫苗，其特征在于肽抗原具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。 

在对口蹄疫病毒抗原表位充分了解的基础上，通过试验动物筛选得到口蹄疫病毒的优势B细胞抗原表位及其最佳组合方式，进而通过大量 试验室试验在小反刍兽疫病毒上找到了一段能增强口蹄疫VP1上优势B细胞表位的强效外源T细胞表位，然后通过一定的接头氨基酸将强效外源T细胞表位和优势B细胞表位连接，构建了含辅助性强效外源T细胞表位和FMDV主要抗原表位基因的多肽疫苗，并通过计算机模拟完全符合设计要求。 

上述的肽苗，其可以采用化学合成的方法制备合成肽抗原。 

本发明还提供了该肽疫苗的制备方法，主要包括以下步骤：