[发明专利]一种戊型肝炎病毒RNA检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种对戊型肝炎病毒(HEV)各种基因型的核酸(RNA)进行体外定性检测的试剂盒及检测方法，可辅助人类临床戊型肝炎的诊断、治疗以及动物HEV感染的诊断。

背景技术

戊型肝炎(HE，简称戊肝)与甲型肝炎相似，是一种经肠道传播的自限性疾病。直到1980年，特异敏感的甲型肝炎抗体检测试剂应用于印度发生的水源爆发流行性肝炎，人们才认识到有一种与HAV具有类似流行病学特征及临床表现但又不同于HAV的病毒，被称为经肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒。1983年，前苏联Balayan首次在电镜下观察到非甲非乙型肝炎病毒颗粒，并将其传染至一位志愿者和猕猴体内引起典型的肝炎症状。随后，其他科学家采用分子生物学的技术成功地克隆出该病毒，证明其为不同于其他肝炎的病毒，被命名为戊型肝炎病毒(HEV)。HEV病毒主要通过粪-口途径传播，有流行和散发两种形式。

HEV是一种直径为27nm~34nm的无包膜单股正链RNA病毒。在核苷酸和氨基酸具有高度同源性的基础上有广泛的地理分布和一定的遗传异质性等特点。HEV基因组全长约7.5kb，包括长150~200个腺苷酸的3’poly(A)尾。以I型代表株缅甸株为例，其5’端含有27个核苷酸(nt)的非编码区(NCR)，3’端含有65~74个核苷酸的非编码区，在5’和3’非编码区之间含有三个开放读码框架(ORF)，依次为ORF1、ORF2和ORF3，ORF1(nt28~5107)编码非结构蛋白，主要包含一些病毒复制所需要的酶类；ORF2(nt5147~7126)编码衣壳蛋白，是病毒的结构蛋白，可诱导机体产生保护性免疫反应；ORF3(nt5106~5474)功能尚不清楚，但含有可被患者血清抗体识别的抗原表位。

戊肝主要发生在第三世界国家，已有如阿富汗、墨西哥、中国、埃及、印度、蒙古、缅甸、泰国、突尼斯、苏丹、乌兹别克斯坦等29个国家和地区报道过戊肝的爆发并经血清学证实。文献首次报道的戊肝爆发流行发生于1955年印度新德里。1986-1988年中国新疆发生了最大规模的戊肝爆发流行，据报道在此期间共有119,280例戊肝患者出现。

酶联免疫试验(EIA)是目前检测抗-HEV最常用的方便方法。一般情况下，HE的诊断标准是通过ELISA检测患者急性期血清中特异性抗HEV IgM抗体，或抗HEV IgG抗体由低到高4倍以上的变化。

EIA中用来检测抗HEV抗体IgG和IgM时所用的抗原为公认的HEV结构区ORF2和ORF3免疫原性表位的重组蛋白或合成肽。目前所用到的大部分重组蛋白来源于ORF2的C末端或一部分，及ORF3的全长或C末端。目前，有两种EIAs在全世界应用范围较为广泛：一种是Genelabs-EIA，它使用的抗原来源于原型缅甸株和墨西哥株的ORF2和ORF33’末端的4个短序列重组蛋白；一种是Abbott-EIA，它使用的抗原是源于原型缅甸株的ORF2部分序列和ORF3全长表达的两个重组蛋白。

但在下列因素下：(1)采血时正处于HEV感染的窗口期，抗HEV尚未阳转(2)即使在发病早期抗-HEV IgM阳性率仅为60％~80％^[54](3)患者对HEV无应答。这些情况均会导致戊型肝炎病毒感染者的血清学标志物呈阴性反应，从而有可能造成漏诊的情况。由于所用抗原不同，也会造成检测结果的不一致。研究发现，当以不同基因型和亚型的HEV毒株表达的抗原对HE患者进行血清学检测时，即可表现出不同的敏感性。即使用相同基因型和亚型的毒株，采用不同的表达体系、不同的基因位点，所得到的抗原其抗原性也会不同。所以用ELISA方法诊断戊型肝炎病毒的感染也存在一定程度的不确定性。

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术自1989年开始被应用于临床诊断以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快成为临床实验诊断学的一个技术热点，目前，已广泛用于临床疾病的诊断和治疗监测。自1990年Reyes等首先应用RT-PCR法检测实验感染的猕猴胆汁中HEV RNA以来，RT-PCR方法在戊肝的研究中广泛应用。在急性期血清或粪便中可用RT-PCR对HEV检测，此法也可检测污染的水源和其他污染物中的HEV^[57]。考虑到在急性发作后期HEV病毒血症和粪便排泄物会逐渐减弱，因此PCR尽可能早做。