[发明专利]一种戊型肝炎病毒RNA检测试剂盒

权利要求书

1.一种针对不同基因型的戊型肝炎病毒RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由核酸分离试剂和扩增检测试剂组成，其中，

核酸分离试剂的组成为：

核酸吸附柱：硅胶膜吸附柱；

助沉剂：具有沉淀核酸的物质；

洗液A：异硫氰酸胍液和Tris/HCI液；

洗脱液：Tris/HCI缓冲液；

套管：无核酸酶套管；

裂解液：异硫氰酸胍液，Triton X-100液，Tris/HCI液；

洗液B：Tris/HCI缓冲液；

扩增检测试剂的组成为：

HEV反应液：由HEV特异性PCR引物、HEV特异性Taqman荧光探针、1×PCR缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸混合物和depc水混合配制而成；

逆转录酶：具有RNA逆转录活性的逆转录酶；

DNA聚合酶：具有DNA复制活性的聚合酶；

HEV阴性对照：新生牛血清溶液，或者阴性血清；

HEV临界阳性对照：含HEV人工假病毒的新生牛血清、阴性血清、或者其他无HEVRNA的基质；

HEV强阳性对照：含HEV人工假病毒的新生牛血清、阴性血清、或者其他无HEV RNA的基质。

2、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，其中，

核酸分离试剂的组成为：

核酸吸附柱：2.0ml无核酸酶套管，内含一个可拆卸的硅胶膜吸附柱；

助沉剂：Acryl多聚物；

洗液A：5M异硫氰酸胍液，10mM Tris/HCI液；

洗脱液：10mM Tris/HCI缓冲液；

套管：为2.0ml无核酸酶套管；

裂解液：5M异硫氰酸胍液，10％Triton X-100液，10mM Tris/HCI液；

洗液B：10mM Tris/HCI缓冲液；

扩增检测试剂的组成为：

HEV反应液：由0.10-0.20mmol/L HEV特异性PCR引物，0.10-0.20mmol/L HEV特异性Taqman荧光探针，100mmol/L Tris-HCl，pH9.2，500mmol/L KCl，10mmol/LMgCl21×PCR缓冲液，dATP/dTTP/dGTP/dCTP各0.10-0.20mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸混合物和depc水混合配制而成；

逆转录酶：AMV逆转录酶；

DNA聚合酶：Taq聚合酶；

HEV阴性对照：新生牛血清溶液，或者阴性血清；

HEV临界阳性对照：含HEV人工假病毒的新生牛血清、阴性血清、或者其他无HEVRNA的基质；

HEV强阳性对照：含HEV人工假病毒的新生牛血清、阴性血清、或者其他无HEV RNA的基质。

3、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，是根据Taqman荧光探针原理来实现对戊型肝炎病毒核酸的检测。

4、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，检测对象为人和动物血清、血浆和粪便中的戊型肝炎病毒RNA。

5、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，使用基因工程构建的HEV人工假病毒作为戊型肝炎病毒RNA检测试剂盒的强阳性对照和临界阳性对照，另外作为对产品进行质量控制的质控物。

6、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，使用提高的退火温度以实现提高逆转录PCR扩增反应效率的目标。

7、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，在核酸分离试剂中加入助沉剂以提高核酸分离的灵敏度和回收率。

8、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒可适用于各种全自动荧光PCR扩增仪。

9、权利要求1的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒可用对临床戊型肝炎进行早期诊断。

10、权利要求1的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，

试剂盒组份的配制：

核酸吸附柱：外购，质检合格后作为试剂盒组份，

套管：为2.0ml无核酸酶套管，

助沉剂：外购，质检合格后作为试剂盒组份，

裂解液的配制：分别取异硫氰酸胍590.8克，100ml Triton X-100，加入到10mMTris/HCI(pH8.0)中，溶解后定容至1000毫升，高压灭菌，质检合格后分装作为试剂盒组份，

洗液A的配制：分别取异硫氰酸胍590.8克，加入到10mM Tris/HCI(pH8.0)中，溶解后定容至1000毫升，高压灭菌，质检合格后分装作为试剂盒组份，洗液B的配制：称取1.57克Tris.base溶于depc水中，用浓HCI调节pH值至7.0，定容至1000毫升，高压灭菌，质检合格后分装作为试剂盒组份，

洗脱液的配制：称取1.57克Tris.base溶于depc水中，用浓HCI调节pH值至8.0，定容至1000毫升，高压灭菌，质检合格后分装作为试剂盒组份，

HEV反应液的配制：

在一个无核酸酶的容器中，先后加入300μl 10×PCR缓冲液，120μl MgCl2，21μl 25mM dNTPs，2μl上游引物贮存液，4μl下游引物贮存液，4μl荧光探针贮存液，补加depc水至1920μl，避光混匀，于2-8℃保存，质检合格后分装作为试剂盒组份，

AMV逆转录酶，外购，质检合格后分装，作为试剂盒组份，

Taq DNA聚合酶：外购，质检合格后分装，作为试剂盒组份，

HEV阴性对照：新生牛血清溶液，

HEV临界阳性对照：将HEV人工假病毒以1∶1000000倍用新生牛血清稀释，作为试剂盒组份，

HEV强阳性对照：将HEV人工假病毒以1∶10000倍用新生牛血清稀释，作为试剂盒组份，

试剂盒组份的包装

本品共包括两个包装盒，分别为核酸分离试剂盒和检测试剂盒，其中核酸分离试剂盒中共含7种组份，分别包括核酸吸附柱1包(48个)、套管(96个)、助沉剂1管、裂解液1瓶、洗液A1瓶、洗液B1瓶和洗脱液1瓶，检测试剂盒中共含6种组份，分别包括HEV反应液1管、AMV逆转录酶1管、TaqDNA聚合酶1管、HEV阴性对照1管、HEV临界阳性对照1管和HEV强阳性对照1管，

成品试剂盒的检定：

本品需要通过成品试剂盒的出厂检验，采用企业质控品进行检定，合格后使用，

1).物理检查：外观整齐，组份齐全，液体组份无渗漏，

2).特异性质控品符合率：7份特异性质控品不得出现假阳性，

3).阳性质控品符合率：6份阳性质控品不得出现假阴性，

4).最低检出量：4份灵敏度质控品必须检出3份，

5).精密性：对精密性质控品重复检定5次，计算Ct值的变异系数，CV(％)＜10％。