[发明专利]检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物及其检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明主要涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到藏 绵羊腐蹄病抗性等位基因的检测。

背景技术：

绵羊腐蹄病是由节瘤拟杆菌引起高度接触性传染病，其特征是蹄局部组织发炎、坏 死。绵羊患病后生长不良、掉膘、羊毛品质下降，病情严重且得不到及时治疗时会引起 羊只死亡。藏绵羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季节爆发，如在甘肃和青海境内 的藏绵羊发病率高达30％以上，死亡率最高可达10％，严重影响牧区养羊业发展。

动物主要组织相容性(基因)复合体(major histocompatibility complex，MHC)与多 种疾病有密切关系，是目前开展抗病育种的首选基因座或候选基因。绵羊主要组织相容 性(基因)复合体也称为OLA(ovine lymphocyte antigen)，OLA II区与人的相似，区 域内的DQ和DR 2个基因家族表现丰富的多态性，但绵羊的多态性更集中在DQ家族。 OLA-DQ基因家族有2个DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多态性。

目前国内绵羊腐蹄病主要采用药物防治措施，较难控制病情且有药物残留风险。在 国外OLA-DQA2基因已经作为抗腐蹄病的遗传标记加以应用，并且该检测已商业化并用 来开展抗病选育。藏绵羊腐蹄病抗性分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测绵羊 的DQA2基因第2外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的 羊只对腐蹄病的抗性强弱，从而判断是否可以留作种用。

发明内容：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等 位基因的特异性扩增引物及其引物的扩增条件。

本发明的另一目的是提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒。

本发明的还有一个目的是提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒的 使用方法。

以解决快速、敏感性高、成本低用于藏绵羊腐蹄病抗性分子选种技术。

本发明利用PCR-SSCP对表型正常和患腐蹄病藏绵羊OLA-DQA2基因第2外显子 进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合表型观测 资料，确定易感等位基因和抗性等位基因，并指导藏绵羊没有感染时的抗病选育。

本发明涉及一种藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法及检测试剂盒。通过 PCR-SSCP对藏绵羊基因组DNA进行检测，分析羊只是否携带腐蹄病抗性等位基因， 从而判断是否可以留作种用。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位 基因的特异性扩增引物，其主要特点是第一组引物上游长度为24bp的核苷酸，下游长度 为22bp的核苷酸，第二组引物上游长度为23bp的核苷酸，下游长度为24bp的核苷酸， 包括用于扩增OLA-DQA2基因第2外显子的特异性引物，序列如下：

上游引物24bp：DQA2-up：CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；

下游引物22bp：DQA2-dn：CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；

上游引物23bp：DQA2s-up：ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；

下游引物24bp：DQA2s-dn：GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC；

其中R＝A或G，Y＝C或T。

所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，是所述的PCR-SSCP扩 增引物的扩增条件为：

第一次第一组引物：PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火 64℃30s，延伸72℃50s，共32个循环，最后72℃延伸5min；

第二次第二组引物：PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火 67℃30s，延伸72℃30s，共32个循环，最后72℃延伸5min。

所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒，组成成分用量及浓度为：四种 引物各为0.5μL/10pmol，dNTP为1.2μL/2.5mm，Taq DNA聚合酶为0.2μL/2.5U/μL， 10×buffer为2.0μL含Mg²⁺15μM，双纯水为14.6μL。