[发明专利]检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物及其检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，其特征是藏绵羊易感等位基因和抗性较强等位基因的确定步骤为：

(1)收集表型正常和患腐蹄病藏绵羊基因组DNA；

(2)利用扩增绵羊腐蹄病相关基因DQA2基因多态性的特异性扩增引物；所述的扩增绵羊腐蹄病相关基因DQA2基因多态性的特异性扩增引物的第一组引物上游引物(DQA2-up)长度为24bp的核苷酸，下游引物(DQA2-dn)长度为22bp的核苷酸，第二组引物上游引物(DQA2s-up)长度为23bp的核苷酸，下游引物(DQA2s-dn)长度为24bp的核苷酸，包括用于扩增OLA-DQA2基因第2外显子的特异性引物，引物序列如下：

第一组引物：

上游引物24bp：DQA2-up：CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；

下游引物22bp：DQA2-dn：CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；

第二组引物：

上游引物23bp：DQA2s-up：ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；

下游引物24bp：DQA2s-dn：GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC；

其中R＝A或G，Y＝C或T。

(3)用上述特异性引物DQA2-up和DQA2-dn扩增步骤(1)中的DNA特异性片段；

(4)用上述特异性引物DQA2s-up和DQA2s-dn扩增步骤(3)中的PCR产物；

(5)用步骤(4)中的PCR产物进行SSCP检测；

(6)克隆、测序步骤(5)中产生的各等位基因序列；

(7)根据(5)的基因型判别结果，结合表型观测资料，确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因和抗性等位基因；

(8)确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，所述OLA-DQA2*H

的核苷酸序列为：actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg

gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattca 

caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata tcatgattaa

acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc，抗性等位基因为

OLA-DQA2*L，其核苷酸序列为：actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acaccctgga

atttgacgaa gacgagctgc tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt

ggccagtttg caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg

tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc。

2.如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，其特征在于，检测所述的藏绵羊DQA2基因的PCR扩增条件为：

第一组引物：PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火64℃30s，延伸72℃50s，共32个循环，最后72℃延伸5min；

第二组引物：PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火67℃30s，延伸72℃30s，共32个循环，最后72℃延伸5min。