[发明专利]百合无症病毒检测方法所用的PCR引物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测百合无症病毒的引物及其检测试剂盒。

背景技术

百合无症病毒学名为：Lily symptomless virus(LSV)，是严重影响百合花卉生产的主要病毒之一。该病毒属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，广泛分布于瑞典、英国、德国、丹麦、荷兰、比利时、意大利、拉脱维亚、美国、加拿大、日本等国家。

该病毒主要侵染百合科植物，多为系统侵染，一般不会造成明显症状，但会造成百合采后下部叶片提前黄化，影响瓶插寿命，与黄瓜花叶病毒(CMV)复合侵染时，可造成脉明、花叶、畸形、坏死斑等症状。

自然条件下由蚜虫非持久性传播，介体蚜虫有棉蚜、桃蚜，百合汁液和种子不具传播性。该病毒粒子弯曲状，大小为640×17∽18nm(病毒颗粒的长度×宽度)，为RNA病毒，基因组全长8393bp，共有6个开放阅读框(ORF)，只编码5个蛋白，从5’端到3’端分别为25KD、12KD、7KD、32KD和16KD，其中最长的ORF为876bp，编码32KD病毒外壳蛋白。外壳分子量为32KD，由292个氨基酸组成，核酸约占粒体重的8.3％，病毒颗粒沉降系数为172S，A260/280＝1.20-1.43，致死温度为65-70℃，稀释限点为10^-5。

我国每年从国外特别是荷兰进境大量的百合种球用于生产鲜切花，为了严防其携带百合无症病毒，必须加强对进境百合种球中该病毒的检测。由于种球中带毒率及浓度很低，用一般的酶联检测方法难以检出，最好应用分子生物学即RT—PCR的方法才能最大限度的检出该病毒。本试剂盒正是为了更好的服务于口岸对该病毒的检测而发明的，对于截获该病毒、保护我国百合花卉业可持续的健康发展具有非常现实的重要意义。

目前，也有人用PCR检测百合无症病毒，但是用的二步法，即：反转录RT步骤与PCR扩增步骤分开进行，不仅非常容易交叉污染，还费时费力，检测灵敏度也不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测百合无症病毒的引物及其检测试剂盒，用本发明试剂盒进行检测，反转录RT与PCR扩增一步完成，能大大降低交叉污染的机率，又使检测效率大幅度提高，同时检测灵敏度也非常高，操作简单方便，防止交叉污染。

木发明提供的技术方案是：一种用于百合无症病毒的PCR检测引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID No.1所述，即：LSV-1:5’-GAY GAR YTY TTY AAR ATG AAR GT-3’，下游引物核苷酸序列如SEQID No.2所述，即：LSV-2:5’-ARY TGY TTR TGY GCR TTR TG-3’，其中R为A或G，Y为C或T。

一种百合无症病毒的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品百合总核酸或RNA，备用；

(2)第(1)步提取的RNA为模板，利用所述的引物进行RT-PCR扩增；

(3)取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品是否呈阳性，若出现扩增条带的长度为483bp，则待测样品呈阳性。

所述的方法，其特征在于：第(1)步提取待测百合总核酸的步骤如下：

1)取待检测嫩叶片0.1-0.2g，放置于1.5mL的离心管中，液氮冷冻；

2)通过振荡器剧烈振荡，用玻璃棒将叶片研碎；

3)加入0.6mL CTAB提取缓冲液匀浆+2％2-ME，振荡混匀；

4)65℃温育30min；再加入0.5mL氯仿，混匀5min；

5)12000rpm离心5min，上层水相移至一新的离心管中；

6)加入1×倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min；

7)12000rpm离心10min，弃去上清；

8)70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min；再用100％乙纯洗一次；

9)弃去上清，真空干燥5min；

10)沉淀溶于50uLTE(pH8.0)之中，-20℃保存备用。

所述的方法，第(2)步中，进行RT-PCR的反应条件如下：首先50℃ 30min反转录；然后94℃变性3min；再94℃ 30sec，47℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；最后72℃10min。

一种检测百合无症病毒的试剂盒，包含所述的引物。

所述的试剂盒，还包括酶混合试剂，Buffer缓冲液，百合无症病毒阳性对照，无RNA酶去离子水。