[发明专利]百合无症病毒检测方法所用的PCR引物及其检测试剂盒

权利要求书

1、一种用于检测百合无症病毒的PCR检测引物，其特征在于：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即：LSV-P1：5’-GAY GAR YTY TTY AAR ATG AAR GT-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：LSV-P2：5’-ARY TGY TTR TGYGCR TTR TG-3’，其中R为A或G，Y为C或T。

2、一种百合无症病毒的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品百合总核酸或RNA，备用；

(2)第(1)步提取的总核酸或RNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增；

(3)取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品是否呈阳性，若出现扩增条带的长度为483bp，则待测样品呈阳性。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：第(1)步提取待测百合总核酸的步骤如下：

1)取待检测嫩叶片0.1-0.2g，放置于1.5mL的离心管中，液氮冷冻；

2)通过振荡器剧烈振荡，用玻璃棒将叶片研碎；

3)加入0.6mL CTAB提取缓冲液匀浆+2％ 2-ME，振荡混匀；

4)65℃温育30min；再加入0.5mL氯仿，混匀5min；

5)12000rpm离心5min，上层水相移至一新的离心管中；

6)加入1×倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min；

7)12000rpm离心10min，弃去上清；

8)70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min；再用100％乙醇洗一次；

9)弃去上清，真空干燥5min；

10)沉淀溶于50uLTE(pH8.0)之中，-20℃保存备用。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：第(2)步中，进行RT-PCR的反应条件如下：首先50℃ 30min反转录；然后94℃变性3min；再94℃ 30sec，47℃1min，72℃ 1min，35个循环；最后72℃ 10min。

5、一种检测百合无症病毒的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物。

6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括酶混合试剂，Buffer缓冲液，百合无症病毒阳性对照，无RNA酶去离子水。