[发明专利]溶解和结合荚膜多糖的疫苗

说明书

本申请是国际申请号为PCT/IB02/03191、国际申请日为2002年6月20日、 进入中国国家阶段的申请号为CN02812444.8、发明名称为“溶解和结合荚膜多糖 的疫苗”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及抗脑脊膜感染和疾病的疫苗。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriamemingitidis)是革兰氏阴性的人类致病菌。它 寄生在咽部，导致脑脊膜炎并且有时不发生脑脊膜炎而导致败血病。它和淋病奈瑟 球菌紧密相关，但明显和脑膜炎双球菌区别的特征是，存在一种多糖荚膜，它存在 于所有的致病脑膜炎双球菌中。

基于有机体的荚膜多糖，12种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组已经被确认(A、B、C、 H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组经常是sub-Saharan非洲皮肤疾病中所 含有的致病菌。血清组B和C是美国和大多数发达国家绝大多数病例的致病菌。血 清组W135和Y是美国和其它发达国家剩余病例的致病菌。

来自脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖典型的配制方法包括步骤为沉淀(例如应用 阳离子洗涤剂)、乙醇分馏、冷石碳酸提取(除去蛋白质)以及超离心(除去LPS)[例 如参考资料1]。

来自血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖四价疫苗已经知道很多年了[2，3]并 且已经批准应用于人类。虽然在青少年和成年人中有效，它引起低的免疫应答和较 短的保护时间，不能应用于婴儿[例如4]。这是因为多糖是T细胞独立的抗原，产 生不能提高的较弱免疫应答。在这种疫苗中的所述多糖不共轭并以1∶1∶1∶1的比例 [5]存在。MENCEVAXACWY^TM各自包含50μg从冻干形式重组获得的提纯多糖。

共轭血清组C寡糖也批准应用于人类[例如Menjugate^TM；参考资料6]。然而仍 需要发展针对血清组A、W135和Y的共轭疫苗，并生产它们。

发明内容

本发明提供了一种提纯细菌荚膜多糖的方法，它包括的步骤有(a)沉淀所述的 多糖，接着(b)用乙醇使沉淀的多糖重新溶解。所述的多糖可以用来配制疫苗，如 轭合疫苗，尤其是针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、W135和Y的疫苗

沉淀和乙醇溶解

本文知道了很多沉淀可溶性多糖的技术。优选的方法是应用一种或多种阳离子 洗涤剂。所述洗涤剂优选的通常有以下式：

其中：R₁，R₂和R₃相同或不同，各自代表烷基或芳基；或R₁和R₂与其所结合的 氮原子一起形成一种5-或6-元的饱和杂环，R₃代表烷基或芳基；或R₁，R₂和R₃与 其所结合的氮原子一起形成一种5-或6-元的杂环，氮原子不饱和，R₄代表烷基或 芳基，X^-代表阴离子。

在所述方法中特别优选的洗涤剂是四丁铵盐和十六烷基三甲铵盐(例如溴盐)。 十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)特别优选[8]。CTAB也可以是溴化十六碳烷基三甲 铵、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimoniumbromide)、塞太弗伦和Centimide。其 它的洗涤剂包括海地美溴铵(hexadimethrinebromide)和溴化十四烷基三甲铵盐。

荚膜多糖在培养过程中释放入介质。相应的，用来沉淀的初始材料典型的会是 来自离心细菌培养物的上层清液或是浓缩的培养物。

沉淀的步骤也许对于多糖来说是有选择性的，但它也会典型的同时沉淀其它组 分(例如蛋白质、核酸等等)。

沉淀的多糖可以通过在溶解之前的离心而收集。

在沉淀之后，所述多糖(典型的以阳离子洗涤剂复合物的形式)重新溶解。为了 使污染物(例如蛋白质、核酸等)最少化，要优选的应用对于所述多糖有相对选择性 的溶剂。已经发现乙醇在这方面有优势，并且它对于所述的CTAB-多糖复合物是高 度选择性的。其它较低的醇也可以应用(例如甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2- 丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二醇等等)。