[发明专利]检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，特别是生物检测技术。具体涉及一种利用分子生物学SELEX技术设计的能够特异性检测人慢性粒细胞白血病的高亲和力单链DNA适配子及其制备方法。

背景技术

白血病(Leukemia)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病。在我国，白血病被列为十大高发性肿瘤之一，约占肿瘤总发病率的5％左右。其死亡率占我国肿瘤男性第6位、女性第8位，在儿童及青少年中占第1位。慢性粒细胞性白血病，简称慢粒(chronicmyelognous leukemia，CML)，是临床上一种起病及发展相对缓慢的白血病，表现为髓系祖细胞池扩展，髓细胞系及其祖细胞过度生长。我国的CML发病率调查结果为年发病率36/10万，在我国CML约占各类白血病的20％，占慢性白血病的95％。发病年龄分布较广，但发病率随年龄的增长有逐步上升的趋势。临床上白血病的诊断主要依靠血象、骨髓象、细胞化学染色以及用流式细胞仪检测白血病细胞抗原，但是血象检查无特异性，骨髓穿刺具有一定的风险性，且技术要求较高，细胞化学染色结果受影响的因素较多，如试剂、每个实验人员判断标准等，使结果相差很大，流式细胞仪检测价格昂贵，不能作为常规体检的项目对白血病进行人群普查。临床上现有的检测手段诊断出的白血病均已属晚期，如能早期诊断，无论化疗或放疗，治疗效果非常显著，症状、体征可完全消失，血象、骨髓象恢复正常或接近正常。因此白血病的早期诊断成为亟待解决的问题。利用SELEX技术筛选出靶细胞特异性适配子，从而建立白血病的早期特异性检测技术方法。

SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment指数富集的配基系统进化技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组织化学技术，其基本思想是体外构建一个大容量单链寡核苷酸文库，并与靶物质混合，形成靶物质与核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，最后得到特异性强、亲和力高的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶物质范围广、亲和力高、特异性强等优点，已成功应用于多种靶物质的筛选，除用于核苷酸序列、蛋白质、氨基酸(L-精氨酸)外，还可用于染料、金属离子、药物小分子(如茶碱)、生长因子、肽链、类固醇、糖类，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和力和特异性，具有良好的应用前景。目前通过此技术筛选到的靶物质有200多种，筛选出的适配子在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用。

目前，在国内利用SELEX技术筛选特异性适配子方面的研究很多，但是在白血病适配子的开发上还是空白，而且在国外发表的文献仅报道了以急性粒细胞白血病细胞、急性T细胞型淋巴母细胞白血病为材料筛选适配子的方法，然而在慢性粒细胞白血病适配子的制备上没有任何报道。因此本实验筛选出的DNA适配子可以填充空白，而且为慢性粒细胞白血病的诊断、治疗等提供科学依据和实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够特异性结合慢性粒细胞白血病细胞的DNA适配子，该DNA适配子为诊断和治疗慢性粒细胞白血病提供了新的方法，为克服临床上现在不能做到早期诊断、早期治疗的问题，提供了新的解决途径。

本发明的另一目的是提供一种制备能够和慢性粒细胞白血病细胞高亲和力特异性结合的DNA适配子的方法，该方法包括随机单链DNA文库和引物的构建、PCR扩增、生物素-链霉亲和素磁珠分离制备次级文库、SELEX筛选、人中性粒细胞反筛、一级二级结构的分析、适配子亲和力特异性的测定。

本发明的有益效果是：能特异性的结合慢性白血病K562细胞上，而与其他细胞的结合率很低，因此该DNA适配子经修饰可检测和治疗慢性粒细胞性白血病。因为采用了新的组合化学技术-SELEX技术进行慢性粒细胞性白血病的DNA适配子的筛选，确保了获得的DNA适配子可特异性结合在慢性粒细胞性白血病细胞上，从而检测和治疗慢性粒细胞性白血病。另外，本发明制备的DNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同于任何使用的检测物质，且只高亲和力结合慢性粒细胞，对其他细胞并无危害；该DNA适配子也有别于传统的抗体，其分子量小，可快速渗入，经修饰后作为治疗药物携带体，无抗原性，不引起副作用。

附图说明